Masinė žinduolių ląstelių produkcija. Bioreaktoriai.

Free Register

Ląstelių kultivavimas

Ląstelių ir audinių kultivavimas yra kompleksinis procesas, kurio metu ląstelės ir audiniai yra auginami in vitro tam tikromis specialiai kontroliuojamomis sąlygomis. Ląstelių ir audinių kultivavimo sėkmė didele dalimi priklauso nuo dirbtinai sukuriamų sąlygų, kurios privalo maksimaliai atitikti natūralias augimo sąlygas. Pagrindinis kultivavimo tikslas – ląstelių ar audinių padauginimas ir jų išskiriamų produktų panaudojimas žmonių sveikatos gerinimo tikslais. 

Įvairių rūšių žinduolių ląstelės yra plačiai naudojamos rekombinantinių glikobaltymų, monokloninių antikūnų, citokinų, hormonų, fermentų ir kitokių medžiagų gavimui, kurios sėkmingai naudojamos žmonių gydymui. Žinduolių ląstelių panaudojimas rekombinantinių baltymų gamybai yra ypač aktualus, nes ląstelės sugeba produkuoti glikozilintus baltymus, kurie yra identiški žmonių baltymams ir kurių dirbtinė gamyba in vitro yra sunkiai įmanoma (Goocher, 1991; Jenkins and Curling, 1994; Jenkins, 1996). 

Žinduolių ląstelių kultivavimas pareikalavo daug biotechnologinių žinių ir pastangų. Organizmai gali augti skystoje aplinkoje arba prilipę prie kieto paviršiaus, t. y. kultūros gali būti suspensinės ir imobilizuotos. Suspensinės organizmų kultūros yra plačiau naudojamos nei imobilizuotos, kadangi jų kultivavimui nereikalingi paviršiai, o produktas yra pašalinamas kartu su ištekančiu skysčiu. Imobilizavimas plačiąja prasme reiškia ląstelių ar kitų organizmų prilipimą prie įvairių medžiagų, naudojamų paviršių sukūrimui. Dėl paviršinių medžiagų įvairovės tapo įmanoma atlikti biokatalizę (reakcijas ant paviršių) su įvairiomis medžiagomis, tokiomis kaip fermentai, ląstelių organelės, augalų ir žinduolių ląstelės. Imobilizuotų ląstelių privalumas, kad jas galima auginti ilgai, nes jos nepasišalina kartu su skysčiais. 

Žinduolių ląstelių panaudojimo poreikis terapinių baltymų gamybai nuolat auga (Gavrilescu and Chisti, 2005). Pataruoju metu tiek pačių kamieninių ląstelių, tiek ir jų išskiriamų biologiškai aktyvių medžiagų panaudojimas regeneracinėje medicinoje atvėrė naujas papildomas terapines galimybes. Gydymas tokiais produktais kaip antikūnai ar receptorių ligandai reikalauja didelių kiekių. Visi šie minėti ląstelių ir audinių terapinio panaudojimo poreikiai iškėlė biotechnologinį uždavinį plėsti ir greitinti kultūrų auginimo galimybes, ypač stengiantis išvengti didelių papildomų investicijų (Gòdia and Sola, 1995; Brotherton and Chau, 1996). Tuo tikslu buvo pradėti kurti bioreaktoriai, paspartinantys ląstelių ir audinių gamybą in vitro. Šiuo metu yra žinomos įvairios ląstelių kultivavimo sistemos (1 pav.)

1

1 pav. Bioreaktoriai, naudojami žinduolių ląstelių kultivavimui. (Meuwly, 2007)

Žinduolių ląsteles šiais laikais galima kultivuoti iki 20000 litrų tūriuose siekiant pagaminti kuo didesnį reikalingų baltymų kiekį. 

Dabartinės ląstelių kultivavimo sistemos yra skirstomos į: 

  • nejudinamas (plokštelės su daug įvairaus dydžio duobučių, lėkštelės ar flakonai, kultivavimo maišeliai); 
  • judinamas sistemas.

Pagal judinimo būdą, kultivavimo sistemos gali būti skirstomos į: 

  • mechaninio judinimo – naudojant išorines indo judinimo priemones (purtymą, ridenimą, kratymą) ir vidines skysčio judinimo priemones (turinį sukantį ar vartantį veleną, vibruojantį maišytuvą);
  • hidraulinio judinimo – skystis perfuzuoja (prateka) ertmę, kurioje yra kietos dalelės, fiksuotą ar suskystintą paviršius;
  • pneumatinio judinimo – turinys judinamas oro srautais.

Kokio tipo ląstelių auginimo sistemą pasirinkti, sprendžiama pagal poreikius. Moksliniams tikslams dažniausiai naudojamas prilipusių ląstelių auginimas flakonuose, ant membranų, maišeliuose arba naudojant mažo tūrio suspensinius, fiksuoto arba verdančio paviršių bioreaktorius. Dideliems norimo produkto kiekiams gauti dažniausiai naudojami didelio tūrio suspensiniai bioreaktoriai arba keičiamo dydžio fiksuoto ir verdančio paviršiaus bioreaktoriai. 

Bioreaktoriai ir jų tipai 

Bioreaktoriai – tai manufaktūrinis arba inžinerinis įrenginys ar sistema, skirta biologiškai aktyvios aplinkos palaikymui. Bioreaktorius, dažniausiai, sudaro indas, kuriuose vyksta cheminis procesas dalyvaujant organizmams arba biologiškai aktyvioms medžiagoms, išskirtoms iš organizmų. Procesai, vykstantys bioreaktoriuose, gali būti aerobiniai ir anaerobiniai. Ypač didelis biotechnologinis šuolis įvyko 1990–2000 metais, sukūrus bioreaktorius su talpomis, kuriose ląstelės buvo specialiai maišomos, judinamos ir ventiliuojamos (Hu and Aunins, 1997; Varley and Birch, 1999).

Pagal veikimo principą talpą turintys bioreaktoriai skirstomi į įvairias grupes: 

  • su maišymu (angl. batch bioreactors);
  • su maišymu ir medžiagų padavimu (angl. fed batch bioreactors);
  • bioreaktoriai su nuolatiniu maišymu (angl. continuous stirred-tank reactor) 
  • bioreaktoriai su nuolatiniu medžiagų padavimu ir nuolatiniu maišymu (angl. continuous-flow stirred-tank reactor) ir kt.
  • gerai maišantys bioreaktoriai (angl. well-stired batch);
  • vamzdelinius srauto kištukus turintys bioreaktoriai (angl. tubular plug-flow reactors) ir kt.

Pagal dydį, kuris priklauso nuo gaminamo produkto kiekio, bioreaktoriai skirstomi: 

  • Mažus bioreaktorius, naudojamus mokslinių tyrimų tikslams;  
  • Didelius (gaminančius kilogramus reikiamo baltymo), naudojamus medicininiams ir biofarmaciniams tikslams.

Bioreaktoriai taip pat skirstomi pagal specifiškumą:

  • Vienfunkciniai; 
  • Daugiafunkciniai. 

Bioreaktorių sukūrimas yra pakankamai sudėtingas procesas, kurį studijuoja mokslo šaka, vadinama biochemine inžinerija. Bioreaktoriuose esančios sąlygos tiesiogiai veikia jame esančius organizmus, todėl tikslus jų sukūrimas ir palaikymas yra vienas iš svarbiausių uždavinių, užtikrinančių sėkmingą bioreaktoriaus veikimą. Kultūrų augimo sąlygos yra kompleksinės, todėl šiuolaikiniams bioreaktoriams keliama daug reikalavimų, tokių kaip:

  • Švelnus maišymas ir ventiliavimas nepažeidžiant ląstelių;
  • Ląstelių morfologijos, proliferacijos ir diferenciacijos mechanizmų stabilumas;
  • Atitinkamų sąlygų: pH, temperatūros, deguonies ir ištirpusio CO2 koncentracijos palaikymas; 
  • Žemas toksinių metabolitų lygis;
  • Didelė ląstelių ir jų gaminamų produktų koncentracija; 
  • Susidariusio produkto stabilumas ir pakankamo produkto kiekio gamyba;
  • Tinkamos terpės ir jos priedų naudojimas;
  • Ląstelių prilipimo paviršiaus parinkimas ir jo stabilumas;
  • Įvairių procesų automatizavimas, apimties keitimas, procesų (maišymas, terpės keitimas, perfuzija, valymas, medžiagų pridėjimo bei išėmimo) valdymas.
  • Produkto gamybos ekonomiškumas.

Taigi, bioreaktorių įvairovė yra be galo didelė, leidžianti pagaminti ne tik norimą produktą, bet ir reguliuoti jo kiekius bei nuolat tobulinti produkto gavybos technologijas. Tai nenutrūkstantis biotechnologinis procesas. Galima paminėti tik bendrus bioreaktorių gamybos principus, nes kiekvieno produkto gamyba ar ląstelių kultūros auginimas gali turėti ypatingus ir specialiai tik tam tikslui sukurtus kompleksinius bioreaktorius. 

Bioreaktoriai su maišymo kontrole (Batch bioreactors)

Tai bendras pavadinimas bioreaktorių, kurie turi talpą ar indą ir kuriame maišomas esantis turinys. Tokie bioreaktoriai dažniausiai yra naudojami įvairiems industriniams ir biotechnologiniams procesams vykdyti (2 pav.). Šiuose bioreaktoriuose gali vykti: kietų dalelių tirpinimas, produkto maišymas, vykdoma cheminė reakcija, skysčio/skysčio ekstrakcija ar polimerizacija, distiliavimas ar kristalizavimas, suspensinių ir  prie mikronešėjų prilipusių ląstelių auginimas.

2

2 pav. Bendra bioreaktorių su maišymu schema. http://en.wikipedia.org/wiki/Batch_reactor

Pagal tai, koks procesas tuose induose atliekamas, jie vadinami, pvz., kristalizatorius, polimerizatorius, bioreaktorius ir t.t. Paprastai toks reaktorius turi indą, maišymo sistemą ir reguliuojamą šildymą arba šaldymą. Indo talpa varijuoja nuo 1 iki 15000 litrų. Gaminami indai iš plieno, nerūdijančio plieno ar stiklo. Skysčiai ar kietos medžiagos patalpinamos pro angą viršuje. Dujos ar garai taip pat pašalinami per tą pačią angą. Bioreaktoriai su maišymu gali būti pastoviai arba nepastoviai šildomi arba šaldomi. Tokių reaktorių privalumas – jų pritaikymo įvairiapusiškumas. Kadangi medžiagų pridėjimas ir pašalinimas iš tokių reaktorių vyksta tik per vieną angą, todėl dažniausiai šie reaktoriai yra naudojami toksinių reakcijų vykdymui ar kenksmingų produktų gamybai. Ląstelių ar kitokių biologinių objektų auginimui daugiausia yra naudojami talpos bioreaktoriai su maišančia sistema ir skysčių padavimo ar pašalinimo  kontrole (angl. Fed-batch bioreactors). 

Bioreaktoriai su maišymo, skysčių padavimo ir pašalinimo kontrole (Fed-batch bioreactors).

Šie bioreaktoriai labiausiai tinka mikroorganizmų arba gyvūnų ląstelių auginimui. Procesai, vykstantys šiuose bioreaktoriuose yra paprasti, tačiau jų kontrolė yra pakankamai sudėtinga, nes reguliuojami ir maišymas, ir skysčių padavimas ar jų pašalinimas. Tokiose talpose auginami mikroorganizmai, bakterijos ar ląstelės, kurios turi produkuoti tam tikrą norimą produktą. Skysta maitinamoji terpė paduodama į talpą, vyksta organizmų kultivavimas, kurio metu organizmai išskiria produktą į terpę. Pasibaigus procesui terpė pašalinama (3 pav.). Pašalinta terpė toliau naudojama produkto išgryninimui, o ant organizmų užpilamas naujas sterilus skystis ar maitinamoji terpė. Pagrindinis skirtumas lyginant su kitais bioreaktoriais yra tas, kad talpos temperatūra, skysčių padavimas, nusiurbimas ir maišymas yra reguliuojami automatiškai ir priklauso nuo to, kokio produkto reikia (Lee, 1999). Medžiagos, reikalingos produkto gavybai, gali būti pridedamos proceso eigoje arba sudedamos visos iš karto.

3

3 pav. Bioreaktorius su maišančia ir skysčių padavimo-ištekėjimo sistema. http://www.mstarlabs.com/control/bioctrl.html

Tokių bioreaktorių privalumai:

  • Pridedamų reikiamų medžiagų, nuo kurių tiesiogiai priklauso norimo produkto išeiga,  kontrolė (substrato inhibicija). Pvz. pridėjus metanolio, etanolio ar kitų medžiagų stabdančių mikroorganizmų augimą, galima reguliuoti kultūros augimo greitį;
  • Galima pasiekti labai aukštą auginamos kultūros tankį, pvz. iki 50-100 gramų sausų ląstelių/litrui skysčio;
  • Katabolinių, genų raiškos, metabolinių ir kitų svarbių procesų kontrolė. 

Yra ir problemų. Pagrindinės problemos iškyla siekiant palaikyti tinkamas sąlygas, t.y. idealiomis sąlygomis kultūra auga eksponentiniu greičiu. Tačiau, jei maisto medžiagų yra per daug, kultūra auga didesniu nei eksponentiniu greičiu ir nebetelpa talpoje, o jei per mažai – kultūra eksponentiškai nyksta. Vis dėl to, pritaikius tinkamas sąlygas tam tikroms kultūroms auginti, ši sistema puikiai naudojama gamyboje. 

Šiai grupei priklauso savo struktūra panašūs bioreaktoriai, tačiau su labiau reguliuojamomis vienomis ar kitomis funkcijomis, pritaikytomis specialiems poreikiams. Tokie bioreaktoriai yra: nuolatinio maišymo bioreaktoriai (angl. continuous stirred-tank reactor), nuolatinės tėkmės ir maišymo bioreaktoriai (angl. continuous-flow stirred-tank reactor), gerai išmaišantys bioreaktoriai (angl. well-stirred), verdančio sluoksnio bioreaktoriai (angl. fluidized bed reactor), bioreaktoriai su besisukančiomis talpomis (angl. rotating wall vessel bioreactor) ir bioreaktoriai su vamzdelinio srauto kištukais (angl. tubular plug-flow reactors). Tokiuose maišymą turinčiuose bioreaktoriuose didžiausias dėmesys kreipiamas į maišymą ir jo intensyvumą, derinant jį su skysčių kontrole pagal norimų reakcijų vykdymo ar ląstelių auginimo schemą. 

Nuolatinio maišymo bioreaktoriai (Continuous stirred-tank reactor)

Dar kitaip šie bioreaktoriai yra žinomi kaip dugninio maišymo bioreaktoriai (angl. backmix reactors), kurie puikiai tinka cheminei ar biotechnologinei inžinerijai. Šie bioreaktoriai yra naudojami tada, kai produkto gavimui reikia nuolatinio, atitinkamai reguliuojamo, maišymo, nuo kurio priklauso galutinis produktas (4 pav). Bioreaktoriai tinka cheminėms reakcijoms vykdyti dalyvaujant skysčiams, dujoms, koloidams ar mikroorganizmų auginimui. Pagrindinis dėmesys tokiuose reaktoriuose yra skiriamas maišymo reguliavimui, kuris apskaičiuojamas sudėtingomis matematinėmis formulėmis ir priklauso nuo medžiagos tankio, izoterminių sąlygų, pastovumo konstantos, pirminių ir grįžtamų cheminių reakcijų greičių. Jei pasiekiamas tobulas turinio maišymas, tuomet produkto išeiga idealiai atitinka pridėtų medžiagų kiekį, reakcijos laiko ir greičio santykį. Tačiau, jei maišymo greitis netinkamas, produkto išeiga gali sumažėti net 5-10 kartų. Mikrobiologijoje šio tipo reaktoriai yra vadinami chemostatais (4 pav.)

4

4 pav. Nuolatinės tėkmės ir maišymo reaktorius. http://en.wikipedia.org/wiki/Continuous_stirred-tank_reactor

Ląstelių auginimui laboratorinėmis sąlygomis gali būti naudojami šiek tiek kitokie ir mažesni nuolatinio maišymo reaktoriai (5 pav.). Pradinis kiekis ląstelių yra patalpinamas į fibrozinį sluoksnį. Maitinamoji terpė nuolat patenka į reaktorių, prateka per ląsteles, kurios išskiria reikalingus produktus. Susidaręs produktas pašalinamas ir išgryninamas. Maišymas šioje sistemoje vyksta terpėje, esančioje virš ląstelių sluoksnio. Panašus principas naudojamas ir fermentatoriuje. 

5

5 pav. Bioreaktorius su maišymo sistema, skirtas prikabintų ląstelių produktams gauti. http://encyclopedia.che.engin.umich.edu/Pages/Reactors/CSTR/CSTR.html

Nuolatinio maišymo ir skysčio padavimo bioreaktorius (angl. Continuous flow stirred tank reactor)

Tai sistema, kurioje maišymas yra toks idealus ir vienalytis, kad inde nesusidaro jokio koncentracijos gradiento, t. y. paimtas pavyzdys iš indo viršaus bus toks pat kaip indo viduje ar dugne. Maišymas būna mechaninis arba hidraulinis. Tokiame bioreaktoriuje maisto medžiagų patekimas yra lygus jų ištekėjimui. Pagrindiniai faktoriai, įtakojantys tokio bioreaktoriaus veikimą yra: patenkančio skysčio tėkmės greitis, pratekėjimo per bioreaktoriaus tūrį greitis ir ištekėjimo greitis. Jie turi būti suderinti. Jei patenkančio skysčio kiekis bus per didelis, dalis ląstelių, esančių reaktoriuje gali išplaukti į paviršių, o jei per mažas – išdžiūti. Mikrobiologijoje tai vadinama chemostatais. Šie bioreaktoriai turi privalumų, lyginant su gerai maišomais bioreaktoriais, nes skysčių patekimas ir ištekėjimas yra griežtai kontroliuojami, procesas tolygus, todėl pasigamina pakankamas kiekis norimo produkto. Paprastai visi bioreaktoriai yra su maišymu, todėl vienas iš bioreaktorių su maišymu trūkumų yra pakankamai greitas besimaišančių dalelių sudilimas, kurias, norint apsaugoti, galima patalpinti į tam tikrus vamzdelius. Nepertraukiama skysčio padavimo-ištekėjimo ir maišymo sistemos plačiai naudojamos industrijoje.

Gerai išmaišantys bioreaktoriai (angl. well-stirred) – bioreaktorių sistema yra labai panaši savo struktūra į prieš tai minėtus bioreaktorius. Skirtumas tas, kad šiuose reaktoriuose yra naudojamos įvairios maišymo sistemos, tokios kaip maišymas velenu ar keliais velenais, hidraulinis ar dujomis, siekiant pasiekti kuo tobulesnį turinio išmaišymą. 

Verdančio sluoksnio bioreaktoriai (Fluidized bed reactor)

Šio tipo bioreaktoriai yra pritaikyti daugiafazėms cheminės reakcijoms vykdyti arba atsparių maišymui ląstelių auginimui. Skysta fazė (dujos, skystis) prateka per kietą fazę (kristalinę medžiagą, paprastai sferinės formos) pakankamai dideliu greičiu, suspenduojančiu kietą fazę ir tariamai paverčiančiu ją skysta faze. Toks procesas, paprastai, vadinamas skystinimu arba maišymųsi (angl. fluidisation or liquidisation). Kieta fazė tokiame bioreaktoriuje iš kietos ir stabilios yra paverčiama į dinaminę ir panašią į skystį. Skystis, besileisdamas dideliu greičiu, įveikia dalelių gravitacijos jėgą jas pakeldamas, o po to vėl yra stumiamas į viršų ir maišomas su kieta faze, tekėdamas pro tuščius kietų dalelių tarpus. Jei skysčio tekėjimo greitis yra lėtas, tuomet gaunamas suspausto arba lygaus sluoksnio bioreaktorius, o kada skysčio tekėjimo greitis yra didelis, tuomet skysčio arba dujų keliamos jėgos pakanka kietų dalelių pakėlimui. 

Naudojant lėtą skysčio tekėjimo greitį dalelių pakėlimas vadinamas pradiniu skystinimu/maišymusi, kuriam reikia minimalaus skysčio arba dujų tekėjimo greičio. Po pirminio skystinimo bioreaktoriaus turinys pradeda kunkuliuoti arba virti. Toliau didinant skysčio tekėjimo greitį pasiekiamas kritinis taškas, kuomet daleles keliančios jėgos susilygina su gravitacijos jėgomis ir dalelės yra suspenduojamos skystyje. Šiame kritiniame taške paviršius pradeda elgtis kaip skystis. Toliau didinant skysčio arba dujų tekėjimo greitį bendras dalelių tankis tūrio vienete toliau mažėja, maišymasis tampa chaotišku, dalelės nebesudaro paviršiaus, o yra nuolat maišomos. Kieta masė, tapusi skysčiu, gali būti transportuojama vamzdžiais kaip skystis, nereikalaujant mechaninio transportavimo. Maišymosi greitis paprastai parenkamas pagal dalelių dydį ir norimos reakcijos vykdymo ar produkto gavimo metodikas (6 pav.). 

6

6 pav. Verdančio sluoksnio bioreaktoriai. A. Kietos fazės maišymas dujomis; B. Kietos fazės maišymas skysčiu. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Fluidized_Bed_Reactor_Graphic-fr.svg; http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/IMMOB/fluidized-bed.htm

 

Paprasčiausias tokio bioreaktoriaus veikimo principas yra „popkornų“ gamyba. Kukurūzų grūdai yra tolygiai maišomi karštame ore ir tampa tarsi vienalytė masė šokinėdami aukštyn-žemyn. Dėka nuolatinio maišymosi, panašaus į virimą, grūdus veikia vienoda temperatūra, neleisdama jiems sudegti. Pasibaigus grūdų „šokinėjimams“ didesni ir susprogę grūdai yra išstumiami iš indo. 

Jei tokiame reaktoriuje yra auginamos ląstelės, jos yra imobilizuojamos ant mažų dalelių, kurios maišosi su skysčiu. Jei ląstelės yra jautrios maišymui, jas apsaugant galima imobilizuoti į poras turinčias granules. Mažos dalelės sukuria pakankamai didelį paviršių, kurio pakanka normaliam ląstelių prilipimui ir maisto medžiagų patekimui. Tokie bioreaktoriai paprastai yra naudojami, jei substratas yra tirštas arba dujinis, o pagamintas produktas reikalingas nuolatiniam reakcijos vyksmui. 

Bioreaktorius su besisukančiom talpom (Rotating wall vessel bioreactor) 

Šio tipo bioreaktoriai yra skirti švelnaus maišymo reikalaujantiems organizmams auginti. Bioreaktorius yra sudarytas iš dviejų cilindrų į kurių tarpą yra patalpinamos ląstelės su karkasais. Vidinis cilindras yra stacionarus, per jį patenka dujos, o išorinis yra nepralaidus ir sukasi kontroliuojamu greičiu (7 pav.). Ląstelės su augimo terpe patalpinamos į indą. Bioreaktoriui sukantis ląstelės vartosi  skystyje ir gali sudaryti erdvinius 3D konstruktus. Karkasai arba kieti paviršiai taip pat gali būti įdėti į bioreaktorių kartu su ląstelėmis, ant kurių vėliau prilimpa (Lappa, 2003; Waters, 2006).

7

7 pav. Bioreaktorius su besisukančiomis talpomis. http://eprints.nottingham.ac.uk/11772/1/Final_thesis_2011.pdf

Toks bioreaktorius sukuria dinaminę aplinką ląstelėms, turinčią tam tikrus privalumus, tokius kaip efektyvų masės perkėlimą ir mažą trinties sukeliamą stresą (Martin, 2004). Indo sienos sukasi tam tikru greičiu, leidžiančiu subalansuoti gravitacinės, tempimo ir centrifugavimo jėgas, veikiančias karkasus ir ląsteles. 

Bioreaktoriai su vamzdelinio srauto kištukais (Tubular plug-flow reactors)

Naudojami cheminėms reakcijoms, vykstančioms plaukiojančiuose cilindrinės formos vamzdeliuose. Šiuose bioreaktoriuose, vykdant nuolatinę fermentaciją, kultūra teka per vamzdelį viena kryptimi be atgalinio maišymo (8 pav. ). 

8

8 pav. A. Bioreaktoriaus su vamzdelinio srauto kištukais schema. B. Bendras reaktoriaus vaizdas. http://en.wikipedia.org/wiki/Plug_flow_reactor_model; http://encyclopedia.che.engin.umich.edu/Pages/Reactors/PFR/PFR.html

Šiuose bioreaktoriuose maitinančio tirpalo, ląstelių kiekis, masės pasiskirstymas ir produktyvumas yra skirtingas skirtingose vamzdelio vietose. Reaktorius iš viršaus yra nuolat papildomas ląstelėmis ir maisto medžiagomis. Idealiomis sąlygomis skystis teka lyg būtų kietas kamštis, todėl reakcijos greitis visoms plaukiojančioms dalelėms bet kurioje vamzdelio skerspjūvio vietoje yra vienodas. Skystis tokiame bioreaktoriuje gali būti,  pvz., lamininas, nes yra viskozinė medžiaga siauro diametro vamzdeliuose. Toks maišymas labai skiriasi nuo turbulentinio ir intensyvaus maišymo dujomis, nes pastarasis yra vienodesnis. Tačiau maišymas laminino pagalba tinka ir naudojamas vykdant lėtas reakcijas. Trūkumas tas, kad kamščiui keliaujant vamzdeliu vyksta puikus skysčio maišymas radialine kryptimi, bet ne ašine (pirmyn-atgal). Sistemos privalumai – didelio tūrio maišymas, ilgas periodas be turinio keitimo.

Perfuziniai bioreaktoriai

Biotechnologinių procesų spartus tobulinimas, prasidėjęs nuo 1980 metų, nesustoja iki šiol. Kulminacija buvo pasiekta sukūrus suspensinių kultūrų auginimą talpose, kurių veikimo mechanizmai aprašyti ankstesniuose skyriuose. Nors nuo to laiko pasikeitė daug biotechnologinių procesų, ląstelių auginimas įvairaus tipo talpose pasikeitė nežymiai. Vienas iš tokių patobulinimų yra perfuzinės sistemos sukūrimas ir jos pritaikymas perfuziniuose bioreaktoriuose. Tradicinius įvairaus tipo bioreaktorius su medžiagų padavimu ir maišymu (angl. fed batch bioreactor) sudaro 10000-25000 l talpa, kurioje ląstelių kultūros yra auginamos 7-21 dieną. Per tą laiką maisto medžiagos yra sunaudojamos, o išskiriamos medžiagos ir pašaliniai produktai kaupiasi talpoje. Šio proceso metu ląstelės išskiria įvairius produktus į aplinką, o reikiamas produktas vėliau yra išgryninamas iš visos masės. Šiuolaikinė produkto išeiga tokioje sistemoje yra 1-4 g/litre priklausomai nuo naudojamo ląstelių tipo ir kitų medžiagų ar sąlygų. Tokią išeigą pasisekė pasiekti per daugelį metų, keičiant maišymo, skysčių padavimo ir kitokias technines bioreaktorių sąlygas, nes anksčiau išeiga tradiciniame talpos bioreaktoriuje su maišymu buvo žemiau 1g/litre. 

Tuo tarpu perfuziniai bioreaktoriai palaiko ilgą ląstelių auginimo periodą, siekiantį iki kelių mėnesių, todėl, kad ląstelės yra nuolat maitinamos nauja augimo terpe. Yra keletas būdų, kuriais ląstelės palaikomos tokiuose bioreaktoriuose:

  • naudojant kietą substratą ląstelių prilipimui (kapiliarines membranas, granules ar skaidulas);
  • naudojant filtravimo sistemą, kuri sulaiko ląsteles reaktoriuje ir leidžia pašalinti tik skystį;
  • ląstelių atskyrimas centrifuguojant ir grąžinimas jų atgal į bioreaktorių. 

Kieto substrato, naudojamo ląstelių prilipinimui, sistemos yra geresnės nei filtruojamos, nes pasiekiamas didesnis ląstelių tankis, mažesnė ląstelių trintis, apoptozė ir tarša išskiriamais produktais. Bioreaktoriai, kuriuose ląstelės yra auginamos talpose reikalauja didelių kultūrų tūrių (10-20 m3) bet pasiekiamas pakankamai mažas ląstelių tankis. Paprastai suspensinių kultūrų tankis siekia 106-107 ląstelių/ml, tuo tarpu perfuzuojant kultūras pasiekiamas 10 kartų didesnis tankis – 107-108 ląstelių/ml. Perfuzuojant kultūras maitinamoji terpė tam tikru greičiu skalauja pastovaus tūrio kultūras, patalpintas įvairiais būdais ant įvairių paviršių arba imobilizuotas į paviršių poras (Ozturk, 1996; Voisard et al., 2003) (9 pav.).

9

9 pav. Perfuzinis bioreaktorius. 1. Bendra veikimo schema; 2Vieno iš perfuzinių nedidelio bioreaktoriaus vaizdas.

Kadangi ląstelių tankis perfuziniuose bioreaktoriuose yra 10 kartų didesnis, tad ir produkto pagaminama daugiau. Pvz.: 50 litrų perfuziniai bioreaktoriai pagamina tiek, kiek 1000 litrų talpos tradicinis talpos bioreaktorius, o 1000 l talpos bioreaktoriai – tiek, kiek 10000 litrų talpos. Tokie bioreaktoriai turi daug ir įvairių privalumų:

  • nuolatinis maitinamosios terpės keitimas ir produktų pašalinimas, siekiant išvengti toksiškumo efekto išskiriamais produktais; 
  • nuolatinis produkto pašalinimas, leidžiantis greičiau jį išskirti ir išvengti produkto degradacijos; 
  • mažesnė bioreaktoriaus talpa, pagaminanti daugiau produkto; 
  • nereikia didinti talpų, norint daugiau pagaminti produkto, o tai žymiai sumažina gamybos kaštus. 

Trūkumas – sistemos sudėtingumas. Tokių sistemų pritaikymas suspensinių ląstelių auginimui vis dar išlieka komplikuotas (Voisard, 2003). 

Daug kas mano, kad perfuziniai bioreaktoriai yra skirti mažoms produkto gamybos apimtims ir yra sunkiai pritaikomi gamybai. To paneigimas yra produktas Remicade, gautas perfuzuojant kultūrą gamybiniu būdu arba VIII Faktoriaus gamyba Bajerio firmoje. Perfuziniai reaktoriai dabar gaminami daugelyje kompanijų, tokių kaip FiberCell, ZellWerk (Glen Mills firma Amerikoje), Biovest, ATMI, PBS/Refine, AmProtein, Xcellerex, Applikon, ir Wave Biotech.

Šiuo metu ypač populiarūs perfuziniai ląstelių kultivavimo bioreaktoriai yra tuščiavidurių skaidulų (hollow-fiber bioreactors), fiksuoto paviršiaus bioreaktoriai (fixed bed bioreactors), suspausto paviršiaus/sluoksnio bioreaktoriai (packed-bed bioractors), kurie apsaugo ląsteles nuo papildomų stresinių poveikių, sukeltų maišymo dėka.

Tuščiavidurių skaidulų bioreaktorius (Hollow-fiber bioreactors)

Pagrindinis šio tipo bioreaktoriaus veikimo principas yra tas, kad ląstelės ir maitinamoji terpė susisiekia per pusiau pralaidžią membraną, sudarytą iš tuščiavidurių skaidulų. Tuščiavidurės skaidulos – tai vamzdelio pavidalo skaidulos iki 200 mikronų diametro, o molekulinis svoris siekia nuo 5 kd iki 1 μm. Šios skaidulos yra įklijuojamos į kasetės sieneles taip, kad ląstelių terpė, pumpuojama per skaidulų, galus tekėtų per skaidulų vidų, o ląstelės augtų ant skaidulų išorės. Skaidulos sukuria pusiau pralaidžią barjerą, atskiriantį ląsteles nuo tekančios terpės. Prilipusios ląstelės prie tokio skaidulinio paviršiaus maisto medžiagas gauna per poras. Ląstelių persėjimas nebūtinas ir jos gali ilgai išgyventi. Ląstelių išskiriami baltymai kaupiasi užkapiliarinėje ertmėje ir koncentruojasi kelis šimtus kartų labiau nei auginant ląsteles paprastame flakone. Ląstelių koncentracija tokioje sistemoje gali siekti iki 1×108 /mililitre (10 pav.).   

10

10 pav. Tuščiavidurių skaidulų bioreaktoriaus schema. A) Tuščiavidurių skaidulų skersinis pjūvis. B) Viso bioreaktoriaus schema.

http://www.fibercellsystems.com/advantage.htm; http://altweb.jhsph.edu/mabs/ardf/jackson.html

Šio tipo bioreaktoriai daugiausia naudojami tada, kai reikia surinkti didelį kiekį ląstelių išskiriamų baltymų ar kitokių dalelių. Tuščiavidurės ertmės bioreaktoriai naudojami monokloninių antikūnų, rekombinantinių baltymų, citokinų, augimo faktorių, kondicionuotos terpės gamyboje, limfocitų ir kitokių suspensinių ląstelių padauginimui, endotelinių ląstelių kultivavimui po stresinių poveikių, kamieninių ir kitokių ląstelių, kurioms reikalingi užląstelinio matrikso komponentai arba citokinai, kultivavimui.

Taip pat ši sistema labai naudinga ląstelių tyrimams, kuriems ląstelių reikia konfluencinėje (pilnai ląstelėmis padengtas paviršius) arba pokonfluencinėje būsenose. Citokinų ir specifinių matricų įtakos ląstelių proliferacijos tyrimams taip pat tinka ši sistema. 

Apibendrinant galima išskirti šiuos tuščiavidurių skaidulų bioreaktoriaus privalumus:

  • didelis ląstelių tankis (10-100 kartų didesnis nei naudojant kitus ląstelių auginimo metodus;
  • didelė išskiriamų baltymų koncentracija;
  • galimybė selektyviai surinkti norimą produktą reguliuojant skaidulos porų dydį;
  • galimybė kultivuoti didelį ląstelių kiekį, kurį neekonomiška auginti kitais metodais;
  • ląstelių auginimas konfluencinėje būsenoje. Pvz., hibridomos gamina antikūnus 6 mėnesius ir daugiau, o gliomos ląstelės gali augti net 2 metus.

Fiksuoto paviršiaus bioreaktoriai (Fixed bed bioreactors)

Fiksuoto paviršiaus bioreaktoriai tampa vis populiaresni kultivuojant žinduolių ląsteles. Juose galima kultivuoti tiek prilimpančias, tiek ir suspensines ląsteles, jas imobilizuojant į arba ant tam tikrų nešėjų (Portner, 2007) (11 pav.). 

11

11 pav. Fiksuoto paviršiaus bioreaktoriaus schema. (Porter, 2007)

Fiksuoto paviršiaus bioreaktorius sudaro indas, pripildytas ląsteles nešančiomis granulėmis, vadinamomis mikronešėjais. Maitinimo terpė ir deguonis prateka per granules, aprūpindami ląsteles reikiamomis medžiagomis. Terpė ir deguonis teka išilgai bioreaktoriaus ašies (aksialinė tėkmė), o esant didesniam granulių kiekiui tekėjimas gali būti skersinis (radialinis). Siekiant pagerinti tokių granulių naudojimą, jos gali būti integruotos į kondicionuojamus vamzdelius. Dėl ląstelių patalpinimo į mažas erdves (granulių poras), jos gali būti kultivuojamos be serumo ir be baltymų. Tai palengvina tokių bioreaktorių naudojimą. Ląstelių tankis siekia 108 ląstelių/ml, todėl galima pagaminti daug produkto. Moksliniams tikslams galima naudoti ir mažesnės apimties fiksuotų paviršių bioreaktorius (12 pav.).

12

12 pav. Laboratorinis fiksuoto paviršiaus bioreaktorius.

  1. Veikimo schema. B. Bendras laboratorinio bioreaktoriaus vaizdas.

http://www.bioreactors-medorex.com/flycms/Fixed-bed+bioreactors/2033615559.html

http://userpages.umbc.edu/~xkang/ENCH772/packed.html

 

 

Ląstelių imobilizavimas vyksta tuomet, kai ląstelės patenka į korėtas daleles, gelius ar membranas. Nešėjai gali būti organiniai ir neorganiniai. Žinduolių ląstelių kultivavimui naudojamiems nešėjams keliama daug reikalavimų, tokių kaip didelis paviršiaus ir tūrio santykis, toksiškumo nebuvimas, lengva difuzija nuo paviršiaus į centrą, mechaninis ir pH stabilumas, galimybė paviršius sterilizuoti, daugkartinis naudojimas, tinkamumas prilimpančių ir suspensinių ląstelių kultivavimui ir kt. 

Mikroporiniai nešėjai gali būti stikliniai (Looby, 1990), kolageniniai (Ray, 1990), sintetiniai (Gion, 1990) ar keramikiniai. Nešėjai su porų skersmeniu 0,3 mm yra naudojami limpančių ląstelių kultivavimui suspensijoje, 0,3-1 mm skersmens – verdančio sluoksnio bioreaktoriuose, o virš 1 mm skersmens – fiksuotų paviršių sistemose. Šio tipo bioreaktoriai sėkmingai naudojami kepenų ląstelių kultivavimui, retrovirusų gamyboje ar antikūnų gamyboje naudojant hibridomos ląsteles. 

Šiuo metu daugiausiai naudojamos dvi pagrindinės fiksuoto paviršiaus bioreaktorių rūšys, kurios skiriasi fazių ir tekėjimo krypčių įvairumu – tai supakuoto arba suspausto paviršiaus bioreaktoriai (packed bed bioreactors) ir mažos srovės bioreaktoriai (trickle bed bioreactors). 

Suspausto paviršiaus bioreaktoriai (packed-bed bioractors)

Bioreaktoriaus sistema, turinti vieną iš aukščiausią produktyvumų yra supakuoto arba suspausto, lygaus paviršiaus bioreaktoriai (angl. packed-bed bioractors). Suspaustas/plokščias paviršius sudaromas, kuomet tuščias vamzdelis ar kitas indas yra užpildomas granulėmis ar kitokia kieta medžiaga, ant kurios ar kurioje yra ląstelės. Toks užpildas dar vadinamas pakuojančia medžiaga. Pakuojantys vamzdeliai arba talpa gali būti užpildoma katalitinėmis dalelėmis, kompaktiniais žiedais, adsorbentais, granulėmis ir kt. (13 pav.) 

13

13 pav. Pakuojančio paviršiaus bioreaktoriaus vidinė struktūra. A. Pakuojantys žiedai; B. Struktūrinis pakavimas. http://en.wikipedia.org/wiki/Packed_bed

Tokia sistema yra plačiai naudojama ant specialių granulių ar kitokių paviršių imobilizuotų ląstelių auginimui jas perfuzuojant atitinkama maitinama terpe. Dalelės, naudojamos ląstelių imobilizavimui yra panašios į fiksuotų paviršių bioreaktoriuose naudojamas. Skysčio judėjimas gali būti vidinis (cirkuliuojantis viduje bioreaktoriaus) ir išorinis (skystis į bioreaktorių patenka iš kito rezervuaro).

Pakuojančio paviršiaus bioreaktorių sistema taip pat tinka „dirbtinių organų“ kūrimui arba sutrikusio organo gyvybinių funkcijų palaikymui naudojant iš sveiko organo išskirtas medžiagas. Viena iš žinomiausių tokių sistemų šiuo metu yra „dirbtinių kepenų sistema“ (Allen and Bhatia, 2002). Ši sistema yra skirta sutrikusių kepenų funkcijų palaikymui iki donorinių kepenų transplantacijos. Dirbtinė kepenų inkstų sistema aprūpina pažeistas kepenis reikiamomis medžiagomis, gautomis kultivuojant in vitro kepenų ląsteles (hepatocitus). Žmogaus kepenys yra didelis organas, turintis apie 1011 ląstelių vidutiniškai 1,3 litro tūryje. Tai atitinka 108 ląstelių/ml tankį (Stapakis, 1995). Todėl biotechnologams buvo iššūkis sukurti sistemą, palaikančią didelio tankio hepatocitus pilnai funkcionuojančius, bet nesidauginančius tam tikrame plote. Dirbtinių kepenų sukūrimas buvo dar sunkesnis nei kitų dirbtinių organų sukūrimas, kadangi hepatocitai sunkiai auga in vitro sistemoje. Kuriant dirbtines kepenis buvo kombinuojamos įvairios ląstelių kultivavimo technologijos, tokios kaip tuščių skaidulų, monosluosninis ląstelių auginimas, perfuzuojami ir pakuojami karkasai, inkapsuliuotų ląstelių suspensijos ir kt. 

Mažos srovės bioreaktoriai (trickle bed bioreactors)

Tai bioreaktoriai, skirti vykdyti chemines arba biochemines reakcijas, kurių metu skystis arba dujos juda per suspaustas arba katalizuojančias reakcijas daleles (Iliuta, 2006) (14 pav.). Tai yra gana paprasta sistema, daugiausia skirta katalizinių reakcijų atlikimui biofarmacijoje ar aplinkos apsaugos srityse užteršto vandens valymui. Naudojamos ląstelės ar mikroorganizmai yra imobilizuojami ant specialių paviršių ir skystis, panašiai kaip ir prieš tai minėtuose bioreaktoriuose, pro juos prateka. Skirtumas tas, kad terpė yra prisotinama (maišoma) deguonimi viršutiniame sluoksnyje ir tik po to teka per imobilizuotas ląsteles.

14

14 pav. Mažos srovės bioreaktorių veikimo schema. http://en.wikipedia.org/wiki/Trickle-bed_reactor

Šios sistemos privalumas yra tas, kad išvengiama skysčio-dujų interfazės susidarymo, kuri yra kenksminga ląstelių membranoms. Dar vienas privalumas, kad ramybės būsena ir didelis ląsteles pakuojantis paviršius neleidžia skysčiui greitai tekėti, o tai pagerina ląstelių aprūpinimą maisto medžiagomis ir geresnę produkto gamybą bei išeigą. Tokio bioreaktoriaus turinio nereikia dažnai keisti ypač auginant anaerobines kultūras.

Bioreaktoriai, naudojami kamieninių ląstelių auginimui.

Pataruoju metu populiarėjant kamieninių ląstelių tyrimams iškilo nauji biotechnologiniai uždaviniai – pritaikyti jau turimas biotechnologines priemones kamieninių ląstelių auginimui ir jų padauginimui. Šalia antikūnų, vakcinų ir kitokių bioproduktų gamybos atsirado ir kamieninių ląstelių terapijos sritis, reikalaujanti daug ir kokybiškų ląstelių, o ne tik jų produktų. Didelių pastangų prireikė ir vis dar reikia mokslininkams, medikams, biotechnologams, kad laboratoriniai ląstelių auginimo protokolai būtų sėkmingai pritaikyti bioreaktoriuose. Bioreaktoriuose auginamos ląstelės turi išlaikyti kamieninių ląstelių identiškumą, stabilumą, atitikti standartizavimo sąlygas, saugumą ir kitas savybes. 

Vienas pagrindinių principų, būtinų ląstelių terapijoje, yra kuo mažesnės manipuliacijos, atliekamos su ląstelėmis ir autologinė jų panaudojimo sistema, t. y. ląstelės, paimtos iš paciento yra padauginamos sistemoje in vitro ir grąžinamos tam pačiam žmogui suleidžiant į pažeistą organą. Ląstelės iš imunologinius suderinamumo kriterijus atitinkančių skirtingų pacientų taip pat gali būti taikomos kaip alogeniniai transplantantai. Donorų įvairovė, mikrobinis užterštumas, aktyviai proliferuojančių ląstelių galimas suvėžėjimas – tai tik dalis problemų su kuriomis susiduria kamieninių ląstelių pritaikymo klinikoje procedūra (Kirouac, 2008). Dauginant kamienines ląsteles taip pat svarbu išlaikyti jų populiacijos grynumą, diferenciacines savybes ir pakankamą išeigą kuo ekonomiškesnėmis sąlygomis. 

Pritaikant kamieninių ląstelių auginimą bioreaktoriuose taip pat svarbu žinoti, kaip jos auga, t. y. suspensijoje, monosluoksnyje ar agregatuose. Didelį kamieninių ląstelių tankį ir kiekį galima pasiekti naudojant dauguma anksčiau minėtų būdų, t. y. auginant ląsteles ant specialių supakuotų paviršių ar granulių maišančiuose, rotaciniuose, fiksuoto ir verdančio sluoksnių bioreaktoriuose. Iš kitos pusės, per didelis ląstelių tankis gali įtakoti ląstelių funkcijų pasikeitimą. Jautrioms kamieninėms ląstelėms maišymo sistema taip pat gali būti žalinga. Siekiant to išvengti, individualioms kamieninėms, tokioms kaip embrioninės, suaugusio žmogaus at indukuotos pliuripotentinės ląstelės, pritaikomi individualūs auginimo protokolai.  

Žmogaus embrioninės ir suaugusio organo kamieninės ląstelės paprastai kultivuojamos dvidimensinėje (2D) sistemoje auginant jas flakonuose ar lėkštelėse. Tradicinis 2D prilimpančių kamieninių kultivavimas flakonuose ar lėkštelėse yra paprastas, mažai kainuoja ir patogus naudoti, bet ląstelių išeiga nepakankama ir augimo sąlygos in vitro ne visai atitinka natūralias kamieninių ląstelių auginimo sąlygas in vivo. Embrioninės kamieninės ląstelės, ypač dėl jų polinkio augti kolonijomis ir ant maitinančio sluoksnio (neaktyvių fibroblastų), daro šias ląsteles ypač nepatrauklias kultivavimui. Tačiau, pradėjus ląsteles kultivuoti 3D sistemoje, visiškai pasikeitė kamieninių ir kitokių ląstelių auginimo sąlygos. Mechaninės ir cheminės savybės (paviršiaus įtempimo, gravitacijos, prilipimo ir judėjimo) yra pagrindinės ląstelių, audinių ar organų funkcionavime. Ląstelių tarpusavio ryšiai ar su užląsteliniu matriksu palaiko ląstelių augimą ir funkcionavimą 3D mikrostruktūrose (Cukierman, 2002; Lung, 2009).

Vienintelis optimaliausias ir universaliausias kamieninių ląstelių kultivavimo metodas, tinkantis įvairioms ląstelėms, dar neatrastas. Nežiūrint to, bioreaktorių kūrimas ir biotechnologijų tobulinimas, ypač pastaraisiais dešimtmečiais, pasiūlė keletą kultivavimo būdų, tinkančių ir kamieninėms ląstelėms. Tai būtų:

  • bioreaktoriai su maišančiomis sistemomis (ypač oro ir rotaciniu būdais);
  • kultivavimo maišeliai;
  • tuščių skaidulų perfuzinė sistema; 
  • lėto skysčio tekėjimo ir kitos anksčiau minėtos sistemos (Placzek, 2009). 

Anksčiau minėti bioreaktoriai su maišymo sistema išlieka populiarūs ir kamieninių ląstelių auginimui. Šiuo metu naudojami įvairių talpų bioreaktoriai su maišymu: 10 ml (TAP Biosystems), 500 ml (Optimizer system from Wheaton Scientific Products), 5-14 litrų (CelliGen BLU bioreactor from New Brunswick Scientific) ir 2000 litrų (FlexFactory XDR platform from Xcellerex). Šiuolaikiniai bioreaktoriai su maišymu turi pilnai kontroliuojamas augimo sąlygas (pH, temperatūra, deguonies kiekis) naudojamas kamieninių ląstelių kultivavimui ir/ar diferenciacijos tyrimams, o taip pat gali būti pritaikomi 3D auginimo sąlygoms. 

Be jau minėtų bioreaktorių su maišymu, kultivavimo maišeliai, naudojami jau 15 metų, buvo sėkmingai išbandyti daugelio tipų kultūrų auginimui. Maišymas tokiuose maišeliuose vykta juos judinant ant judančių platformų arba naudojant maišeliuose esančias sistemas. Pvz., maišeliai sėkmingai panaudoti iš nervinės keteros išskirtų ląstelių auginimui. Ląstelių proliferacijos ir diferenciacijos galimybės nesiskyrė maišeliuose augintų ląstelių nuo normaliomis (2D) sąlygomis augintų ląstelių (Grainer, 2014) (15 pav.). Tokie maišeliai yra patogūs, nes yra maži (gali būti iki 2 ml tūrio) ir ekonomiški, turi terpės pridėjimo ir pašalinimo angą, taip siekiant išvengti ląstelių užkrato. Ląstelėms terpė pakeičiama jas nucentrifuguojant. Maišeliai yra pralaidūs orui ir turi švelnų maišymą. 

15

15 pav. Kultivavimo maišelių pritaikymas 3D neuronų kultūros auginimui.

  1. Ląstelių kultivavimas;
  2. Ląstelių nuotrauka fazių kontrastiniu mikroskopu;
  3. Erdvinio 3D transfekuotų ląstelių augimo patvirtinimas konfokaliniu mikroskopu. (Greiner, 2014).

Šių maišelių tinkamumas kamieninių ląstelių auginimui jau buvo išbandytas auginant kaulų čiulpų ląsteles ir jas po to transplantuojant hematologinėmis vėžinėmis ligomis sergantiems pacientams (de Lima, 2008). Maišeliuose daugiausia kultivuojamos suspensinės ir agregatus sudarančios ląstelės arba ląstelės, prilipusios ant arba į mikronešėjus.

Kita šiuo metu labai populiari kamieninių ląstelių auginimo sistema yra 3D tuščių skaidulų sistema (16 pav.).

16

16 pav. Mezenchiminių kamieninių ląstelių auginimas perfuziniame tuščių skaidulų bioreaktoriuje: a) perfuzinės kameros skersinis pjūvis; b) perfuzinės talpos vaizdas iš viršaus; c) visa perfuzinio bioreaktoriaus sistema. (Zhao, 2005)

Šią sistemą 1972 metais sukūrė Ričardas Knazekas. Atlikti tyrimai su mezenchiminėmis kamieninėmis ląstelėmis parodė, kad ląstelės auginamos perfuzinėje tuščių skaidulų sistemoje augo gerai, proliferacinis potencialas buvo geras ir ląstelių užaugo 10 kartų daugiau per 40 dienų nei normaliomis 2D sąlygomis (Zhao, 2005). Diferenciacinis potencialas buvo panašus į normalioje aplinkoje auginamas ląsteles (Zhao, 2005). Ląstelių augimas visą laikotarpį buvo eksponentinis, todėl normalių augimo sąlygų, kurios priklauso nuo ląstelių tipo, koncentracijos, terpės tekėjimo greičio, prilipimo paviršiaus tipo, porų dydžio ir kt. sudarymas išlieka kritiniu momentu auginant kamienines ląsteles perfuziniuose reaktoriuose. 

Vykstant procesui bioreaktoriuje terpė yra pumpuojama į talpą su ląstelėmis, po to iš jos vėl susirenka į terpės indą (16 pav.). Per patekimo ir išskyrimo angas yra kontroliuojama tinkama ląstelių auginimui aplinka (O2, CO2, biologiniai parametrai). Visa sistema yra talpinama į 37°termostatą. Sistema turi tris cirkuliacines kilpas: pagrindinę, inokuliacinę ir šviežios terpės padavimo (16 pav.). Ląstelės į bioreaktoriaus augimo talpas yra sušvirkščiamos per tam tikras angas, filtravimo sistemos dėka įtraukiamos į korėtus paviršius ir leidžiama joms prilipti apie 3 val. Baigus ląstelių patalpinimo ant paviršių procedūrą, paleidžiama pagrindinė terpės cirkuliavimo linija. Terpė cirkuliuoja 0,1 ml/min greičiu iki 40 dienų ir keičiama kas 5-8 dienos. Tokie bioreaktoriai yra naudojami siekiant surinkti kamieninių ar kitokių ląstelių išskiriamus produktus, bet ne pačių ląstelių auginimui. Juose sėkmingai auginamos embrioninės, mezenchiminės ar kepenų kamieninės ląstelės.

Kamieninių ląstelių auginimui sėkmingai naudojami ir kompleksiniai bioreaktoriai – oru maišomi bioreaktoriai (angl. Bubble-Column and Air-Lift Bioreactors), kuriuose suderintos kelios anksčiau minėtų bioreaktorių sistemos: mažos srovės bioreaktorius (angl. tricled bioreactors) su fiksuotu arba supakuotu paviršiais (angl. fixed-bed or packed-bed), skystinantis (angl. fluidized-bed) ir oru maišantis (angl. bubble-column). Šiuose bioreaktoriuose oras maišo skystį arba skystį ir kietą fazę, paversdamas ją suspensija. Tokia kompleksinė maišymo sistema užtikrina tinkamą ląstelių aprūpinimą maisto medžiagomis ir reikalingą tankį. 

Pastaruoju metu moksliniams kamieninių ląstelių tyrimams atlikti ypač populiarėja maži arba mikrobioreaktoriai. Jie daugiausia naudojami įvairių naujų auginimo sąlygų ir terpių sukūrimui, proliferacinio ir diferenciacinio potencialo tyrimams. Mikrobioreaktoriai pritaikyti ir 3D ląstelių auginimui (Lund, 2009). Anksčiau minėti bioreaktoriai su besisukančiomis talpomis (Rotary systems) tokie, kaip Cellon from Synthecon-EHSI buvo sėkmingai išbandyti kamieninių ląstelių tyrimuose kosminėmis sąlygomis. Besisukančios talpos palaiko kamienines ląsteles beveik laisvo kritimo sąlygomis, o turinio švelnus maišymasis užtikrina gerą aprūpinimą maisto medžiagomis. Tokie bioreaktoriai žymiai pagerina embrioninių žmogaus kamieninių ląstelių, kurios auga 3D agregatuose, diferenciavimą įvairiomis kryptimis (Dang, 2004). Kamieninių ląstelių diferenciacija į neuronus 3D sistemas sukuriančiuose bioreaktoriuose pagerėja iki 10 kartų, o laikas, reikalingas diferenciacijai, sumažėja iki 30 procentų (Zhao, 2009). 

Kamieninių ląstelių kultivavimas ant arba viduje įvairių mikronešėjų labai praplėtė bioreaktorių naudojimą ir 3D augimo sąlygų sukūrimą. Porų neturintys nešėjai yra naudojami ląstelių auginimui ant jų paviršių. Nors prilipusių ant nešėjų ląstelių augimas yra panašus į 2D sistemas, mezenchiminių ir kasos kamieninių ląstelių augimas vis tiek buvo efektyvesnis nei auginimas flakonuose (Zhao, 2005). Embrioninių ir kitokių suspensinių kamieninių ląstelių auginimas ant porų neturinčių nešėjų reikalauja jų specialaus padengimo matrigeliu ar kolagenu (Nie, 2009). Panašių problemų galima išvengti naudojant specialius mikronešėjus, pagamintus iš alginato, polilaktinės ar hialuroninės rūgšties, į kurių vidų patenka kamieninės ląstelės ir ten sudaro reikalingas 3D struktūras. Tokie hidrogeliai buvo sėkmingai išbandyti ne tik įvairių rūšių kamieninių ląstelių auginimui bioreaktoriuose, bet ir jų transplantacijai į organus (Murua, 2008).  

Apibendrinant galima pasakyti, kad įvairių rūšių bioreaktoriai yra naudojami kamieninių ląstelių kultivavimui ir kiekviena sistema, atsižvelgiant į tai, kokie keliami tikslai, gali būti sėkmingai pritaikoma regeneracinėje medicinoje. Ateityje teks išspręsti dar daug problemų, susijusių su kamieninių ląstelių augimu ir jų pritaikymu. Kol kas daug naujų bioreaktorių dar nepasiekė rinkos, nes nėra pakankamai tinkami ląstelių auginimui. Nežiūrint to, moksliniai biotechnologiniai pasiekimai nestovi vietoje, o jų pritaikymas kamieninių ir kitokių ląstelių auginimui ateityje leis sukurti universalias kultivavimo platformas ir jas pritaikyti regeneracinėje medicinoje. 

Literatūra:

[1] Allen, J.W., Bhatia, S.N. (2002) Improving the next generation of bioartificial liver devices. Cell & Dev Biol 13:447–54.
[2] Bohmann, A., Pörtner, R., Märkl, H. (1995) Performance of a membrane-dialysis bioreactor with a radial-flow fixed bed for the cultivation of a hybridoma cell line. Appl Microbiol Biotechnol  43(5):772-80.
[3] Brotherton, J.D., Chau, P.C. (1996) Modeling of axial-flow hollow fiber cell culture bioreactors. Biotechnol Prog 12:575–90.
[4] Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K.M. (2002) Cell Interactions with Three-Dimensional Matrices. Curr Opin Cell Biol 14:633-639.
[5] Dang, S.M. (2004) Controlled, Scalable Embryonic Stem Cell Differentiation Culture. Stem Cells 22:275-282.
[6] Gavrilescu, M., Chisti, Y. (2005) Biotechnology—a sustainable alternative for chemical industry. Biotechnol Adv 23:471–99.
[7] Gion, T., Shimada, M., Shirabe, K., Nakazawa, K., Ijima, H., Matsushita, T., Funatsu, K., Sugimachi, K. (1999) Evaluation of a hybrid artificial liver using a polyurethane foam packed-Bed culture system in dogs. J Surg Res 82: 131-36.
[8] Gloeckner, H., Jonuleit, T., Lemke, H.D. (2001) Monitoring of cell viability and cell growth in a hollow-fiber bioreactor by use of the dye Alamar Blue. J Immunol Methods 252(1-2):131-8.
[9] Gòdia, F., Sola, C. (1995) Fluidized-bed bioreactors. Biotechnol Prog 11:479–97.
[10] Goochee, C.F., Gramer, M.J., Andersen, D.C., Bahr, J.B., Rasmussen, J.R.  (1991) The oligosaccharides of glycoproteins: bioprocess factors affecting oligosaccharide structure and their effect on glycoprotein properties. Biotechnology (NY) 9:1347–55.
[11] Greiner, J.F., Grunwald, L.M., Müller, J., Sudhoff, H., Widera, D., Kaltschmidt, C., Kaltschmidt, B. (2014) Culture bag systems for clinical applications of adult human neural crest-derived stem cells. Stem Cell Res Ther 5(2):34. 
[12] Hu, W.-S., Aunins, J.G. (1997) Large-scale mammalian cell culture. Curr Opin Biotechnol 8:148–53.
[13] Iliuta, I., Larachi, F. (2006) Dynamics of cells attachment, aggregation, growth and detachment in trickle-bed bioreactors Chemical Engineering Science 61: 4893 – 4908.
[14] Jenkins, N., Curling, E.M.A. (1994) Glycosylation of recombinant proteins: problems and prospects. Enzyme Microb Technol 16: 354–64.
[15] Jenkins, N., Parekh, R.B., James, D.C. (1996) Getting the glycosylation right: implications for the biotechnology industry. Nat Biotechnol 14:975–81.
[16] Kirouac, D.C., and P.W. Zandstra. (2008) The Systematic Production of Cells for Cell Therapies. Cell Stem Cell 3:369-381.
[17] Lappa, M. (2003) Organic tissues in rotating bioreactors: fluid-mechanical aspects, dynamic growth models, and morphological evolution. Biotechnology and Bioenginee-rin  84(5):518–532.
[18] Lee, J., Lee, S.Y., Park, S., Middelberg, A.P. (1999) Control of fed-batch fermentations. Biotechnol Adv 17(1):29-48.
[19] De Lima, M., McMannis, J., Gee, A., Komanduri, K., et al. (2008) Transplantation of ex vivo expanded cord blood cells using the copper chelator tetraethylenepentamine: a phase I/II clinical trial. Bone Marrow Transplant 41:771–778.
[20] Looby, D., Racher, A.J., Griffiths, J.B., Dowsett, A.B. (1990) The immobilization of animal cells in fixed bed and fluidized porous glass sphere reactors. In Physiology of Immobilized Cells (de Bont, J.A.M., Visser, J., Mattiasson, B., and Tramper, J., eds.), Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, Netherlands: 255-64.
[21] Lund, A.W. (2009) The Natural and Engineered 3D Microenvironment As a Regulatory Cue During Stem Cell Fate Determination. Tiss. Eng. B Rev 15:371-380.
[22] Martin, I., Wendt, D., and Heberer, M. (2004) The role of bioreractors in tissue enginee-ring. Trends in Biotechnology 22(2):80–86.
[23] Meuwly, F., Ruffieux, P.A., Kadouri, A., von Stockar, U. (2007) Packed-bed bioreactors for mammalian cell culture: bioprocess and biomedical applications. Biotechnol Adv 25(1):45-56.
[24] Murua A. (2008) Cell Microencapsulation Technology: Towards Clinical Application. J. Contr. Rel 132:76-83.
[25] Nie Y. (2009) Scalable Culture and Cryopreservation of Human Embryonic Stem Cells on Microcarriers. Biotechnol. Prog 25:20-31.
[26] Ozturk SS. (1996) Engineering challenges in high density cell culture systems. Cytotechnology 22:3-16.
[27] Placzek, MR. (2009) Stem Cell Bioprocessing: Fundamentals and Principles. J. Roy. Soc. Interface 6:209-232.
[28] Portner R, Platas OB, Tassnacht D, Nehring D., Czermak, Morkl H. (2007) The Open Biotechnology Journal 1,41-46.
[29] Ray NG, Tung AS, Hayman EG, Vorunakis JN, Rundstadler PW. (1990) Continuous cell cultures in fluidized-bed bioreactors-cultivation of hybridomas and recombinant chines hamster ovary cells immobilized in collagen micropheres. Ann NY Sci 589: 443-57.
[30] Stapakis J, Stamm E, Townsend R, Thickman D. (1995) Liver volume assessment by conventional vs. helical CT. Abdom Imaging 20:209–10.
[31] Varley J, Birch J. (1999) Reactor design for large scale suspension animal cell culture. Cytotechnology 29:177–205.
[32] Voisard D, Meuwly F, Baer G, Kadouri A. (2003) Potential of cell retention techniques for large-scale high-density perfusion culture of suspended mammalian cells. Biotechnol Bioeng 82:751–65.
[33] Waters, S., Cummings, L., Shakesheff, K., and Rose, F. (2006) Tissue growth in rotating bioreactor. Part I: mechanical stabilit Mathematical Mdicine and Biolog  23(4):311–337.
[34] Zhao, F., Ma, T. (2005) Perfusion bioreactor system for human mesenchymal stem cell tissue engineering: dynamic cell seeding and construct development. Biotechnol Bioeng 91(4):482-93.
[35] Zhao, F. (2009) Perfusion Affects the Tissue Developmental Patterns of Human Mesenchymal Stem Cells in 3D Scaffolds. J. Cell Physiol 219:421-429.

Lecturer