Autologinės dendritinių ląstelinių (DL) vakcinos

Free Register
1

Dendritinės ląstelės (DLs)

Dendritinės ląstelės – tai įgimto imuniteto ląstelės, kurių funkcija – identifikuoti, fagocituoti ir įgyto imuniteto ląstelėms pristatyti svetimus antigenus. Tai profesionalios antigeną pateikiančios ląstelės (pAPL), nes kartu su antigenu limfocitams pristato kostimuliuojančius, poliarizaciją bei migravimo pobūdį nusakančius signalus.

Dendritinės imuninės sistemos ląstelės buvo identifikuotos ir aprašytos 1973 metais. Jų atradėjui Ralfui Steinmanui 2011 metais buvo paskirta Nobelio medicinos premija. 2007 metais pats susirgęs kasos vėžiu, 5 metus gydėsi DL vakcinomis ir mirė likus 3 dienom iki Nobelio premijos įteikimo. Dendritinės ląstelės buvo atrastos tyrinėjant pelių blužnies ląstelių suspensiją. Buvo aptiktos naujos, į makrofagus nepanašios, didelės ląstelės su pseodopodijomis („dendritais“), dėl kurių ląstelių forma varijavo nuo pailgos iki žvaigždėtos. Šių ląstelių branduolys buvo didelis ir netaisyklingos formos, o citoplazma pasiskirsčiusi minėtose pseudopodijose [1] (1 pav.). Dėl savo formos naujai atrastos ląstelės įgavo „dendritinių ląstelių“ pavadinimą.

1-1 1-2

1 pav. Dendritinės ląstelės, išskirtos iš pelių blužnies (modifikuota pagal Steinman and Cohn, 1973)

Vėliau R. Steinmanas eksperimentiškai įrodė unikalų šių ląstelių gebėjimą aktyvuoti ir reguliuoti įgytą imuninę sistemą, jų vaidmenį vėžio imunologijoje bei DL vakcinų reikšmę vėžio gydyme. 

Dendritinės ląstelės dėl sugebėjimo specifiškai aktyvinti citotoksinius T limfocitus ir imuninį atsaką nukreipti tinkama linkme [2] bei sukurti imuninę toleranciją organizme [3] šiuo metu sėkmingai naudojamos priešnavikinėje imunoterapijoje bei autoimuninių ligų gydyme.

Pastaruoju metu, gydant onkologinius susirgimus, šalia kitų gydymo būdų vis dažniau taikoma pažangi priešvėžinė gydomoji DL vakcinacija. Šis imunoterapijos metodas yra saugus, gerai toleruojamas, neturintis toksiško šalutinio poveikio, tačiau norimas klinikinis efektas dar nėra pasiekiamas. Šiuo metu atliekant tyrimus ieškoma optimaliausių vakcinos gamybos būdų, jos vertinimo kriterijų, pacientų parinkimo bei gydymo individualizavimo žymenų.

Žmogaus DLs klasifikacija

Dendritinės ląstelės, kaip monocitai ir makrofagai, tradiciškai yra apjungiamos į vienbranduolių fagocitų grupę. DLs aptinkamos limfoidiniuose organuose, jų gausu odos epidermyje (Langerhanso ląstelės), ryklėje, virškinimo ir kvėpavimo trakto gleivinėse, daugelio organų (širdies, plaučių, kepenų, inkstų) intersticiume (organus gaubiančiame audinyje). Per pastarąjį dešimtmetį buvo nustatyta, kad dendritinių ląstelių populiacija yra labai heterogeniška pagal kilmę, lokalizacijos vietą bei atliekamas funkcijas. Nepaisant to, kad dendritinės ląstelės, kaip ir visos kitos kraujodaros ląstelės, yra kilusios iš kaulų čiulpų CD34+ kraujodaros kamieninių ląstelių, jų pirmtakės ląstelės gali būti tiek mieloidiniai, tiek limfoidiniai progenitoriai (2 pav.).

2-1

2 pav. Hemopoezės schema. DLs gali išsivystyti ir iš limfoidinio, ir iš mieloidinio pirmtako.

Pirmame diferenciacijos etape kaulų čiulpų pirmtakai tampa cirkuliuojančiomis progenitorinėmis ląstelėmis, kurios vėliau transendotelinės migracijos keliu grįžta į periferinius audinius. Šiose potencialiose antigeno patekimo vietose cirkuliuojantys dendritinių ląstelių pirmtakai diferencijuojasi į nesubrendusias dendritines ląsteles. Nesubrendusios dendritinės ląstelės pasižymi maža ląstelės paviršiaus MHC žymens ir kostimuliacinių (CD80, CD86) molekulių raiška, tačiau pasižymi aukšta endocitozės, ypač C-tipo lektinų šeimos, receptorių raiška [7]. Šie receptoriai įgalina dendritines ląsteles ir toliau be perstojo aptikti ekstraląstelinius antigenus.

Mieloidinės kilmės žmogaus DLs (dar kitaip vadinamos klasikinės arba tradicinės DLs) sutinkamos ne tik kraujotakoje (3 skirtingos populiacijos), bet ir odoje bei gleivinėse. Plazmacitoidinės (kilusios iš limfoidinių prekursorių) randamos tik kraujyje, 3 pav.

2-2

3 pav. Žmogaus kraujo ir odos DL tipai bei funkcijos (modifikuota pagal Aiala Salvador et al, 2012)

Mieloidinės ir plazmacitoidinės kilmės dendritinių ląstelių tipai pasižymi skirtinga morfologija, žymenų raiška bei atliekamomis funkcijomis. mDLs pasižymi CD11c+ CD123- CD1a- žymenų raiška, o pDLs būdingi CD11c- Cd123+ CD1a- žymenys [5]. 

Pagrindinė mDL funkcija yra egzogeninių (išorinių) ir endogeninių (vidinių) antigenų pateikimas T ir B ląstelėms. Gausiausiai mDL aptinkamos limfoidiniuose organuose. Yra išskiriami trys kraujo mDL potipiai, kurie skiriasi savo fenotipu, anatomine lokalizacija, migracijos keliais ir funkcijomis. Nors neatsakytų klausimų dar išlieka daug, manoma, kad skirtingi kraujo mDLs potipiai aktyvina skirtingas limfocitų populiacijas ir dalyvauja skirtingose imuninėse reakcijose.

Kitas dendritinių ląstelių potipis – plazmacitoidinės dendritinės ląstelės (pDL). pDL, reaguodamos su virusais, bakterijomis ar savomis nukleininėmis rūgštimis, gamina I tipo interferoną (IFN-α/β). Kadangi I tipo interferonas yra labai svarbus priešnavikinio imuninio atsako veiksnys, pDL galėtų būti svarbus priešnavikinio imuniteto komponentas. Praėjusios pirminį aktyvinimą ir esant gausiai I tipo interferono sekrecijai, aktyvintos pDL, kaip ir mDL, subręsta ir tampa pAPL. Tikėtina, kad pDL, geriau nei tokios universalios APL kaip mDL, specializuojasi labai specifinių antigenų (pvz., virusinių, navikinių) pateikime [9].

Dar viena DL grupė – folikulinės dendritinės ląstelės, kurios nesugeba pateikti antigeno ir aktyvinti T limfocitų, nes pagrindinė jų funkcija yra veikti B limfocitus [10]. Jos randamos tik tam tikrose kūno vietose – limfiniuose folikuluose, suformuotuose B limfocitų. Dendritinės ląstelės, išskirdamos citokinus ir augimo faktorius, taip pat prisideda prie B limfocitų aktyvavimo ir diferenciacijos. Prasidėjus imuniniam atsakui, folikulinės dendritinės ląstelės suformuoja daugybę antigeno-antikūno kompleksų, kurie tarnauja ir kaip antikūnų „saugykla“, ir kaip šaltinis B limfocitams stimuliuoti. Sukauptų kompleksų gyvavimo laikas gali siekti mėnesius ar net metus.

DLs brendimas

Dendritinės ląstelės gali būti ramybės būsenoje arba aktyvuotos, dar žinomos kaip nesubrendusios ir subrendusios. Šios dvi grupės skiriasi savo morfologija, fenotipu bei funkciniu aktyvumu.

Periferiniuose audiniuose ramybės būsenoje esančios dendritinės ląstelės vadinamos nesubrendusiomis. Jų fenotipas pasižymi žema paviršinių kostimuliacinių (CD80, CD86) molekulių, migracijos chemokino (CCR7) raiška bei nesugebėjimu sekretuoti T ląstelėms būtinų imunostimuliacinių citokinų [11]. Nesubrendusios dendritinės ląstelės antigenus gauna keliais būdais: 1) makropinocitozės; 2) receptoriais pagrįstos endocitozės per C-tipo lektino receptorius (manozės receptorius, DEC-205) [7] ar Fcc tipo receptorių (CD64) ir II (CD32); 3) fagocitozės (latekso dalelių, apoptotinių ir nekrotinių ląstelių fragmentų, virusų, bakterijų, viduląstelinių parazitų (Leishmania major) virškinimas ir 4) trogocitozės būdu. Tokios nesubrendusios ląstelės pasižymi aukštu endocitiniu aktyvumu, leidžiančiu antigenus praryti ir pateikti juos naiviesiems bei centrinės atminties T limfocitams. Nesubrendusios dendritinės ląstelės T limfocitus aktyvina nepakankamai dėl žemos kostimuliacinių, MHC II molekulių ir vidutinės MHC I molekulių raiškos savo paviršiuje [11]. Toks nepakankamas aktyvinimas sukelia T limfocitų toleranciją, dėl kurios limfocitai tampa anergiškais (sumažėja imuninis atsakas į specifinį antigeną) arba sumažėja antigenui specifinių T limfocitų, ypač CD8+ [12], skaičius. Tolerogeniškumas, kuriuo pasižymi nesubrendusios dendritinės ląstelės, labai svarbus saugant organizmą nuo autoimuninių susirgimų, nes savų antigenų atpažinimas normaliomis sąlygomis nesukelia dendritinių ląstelių brendimo. 

Kad dendritinės ląstelės galėtų sukelti efektyvų imuninį atsaką T limfocitams, jos turi subręsti. Susidūrimas su patogenu ar „pavojaus signalu“ (pakitusiomis endogeninėmis molekulėmis) nesubrendusiose dendritinėse ląstelėse inicijuoja visą kompleksą viduląstelinių persitvarkymų, kuris vadinamas brendimu. Ląstelei bręstant, vyksta morfologiniai, fenotipiniai bei funkciniai pokyčiai: padidėja MHC I ir MHC II klasės molekulių raiška [14]; padidėja kostimuliacinių CD80, CD86 ir adhezijos molekulių raiška [15]; padidėja CD83 molekulės raiška [13]; padidėja sekrecija citokinų, sužadinančių subrendimo signalus ir dendritinių ląstelių potipių formavimąsi [16]; padidėja chemokino receptoriaus CCR7, nukreipiančio subrendusias dendritines ląsteles į antrinius limfoidinius organus, raiška [17], sumažėja endocitinis / fagocitinis aktyvumas [18]. Funkciniai pokyčiai baigiasi ląstelėms pasiekus antrinius limfoidinius organus [8]. Patekusios į limfoidinius organus, dendritinės ląstelės antigeninės kilmės peptidus pateikia ten esantiems naiviesiems T limfocitams. Dėl šios savybės dendritinės ląstelės yra laikomos vienos efektyviausių antigeną pateikiančių ląstelių, naudojamų imunoterapijoje.

Priklausomai nuo subrendimo laipsnio, dendritinės ląstelės gali sukelti pirminį imuninį atsaką (subrendusios dendritinės ląstelės gerokai sustiprina T limfocitų stimuliacines savybes) arba jį slopinti (nesubrendusios dendritinės ląstelės skatina imunotoleranciją) [6]. Manoma, kad nesubrendusios dendritinės ląstelės prisideda prie periferinės tolerancijos vystymosi.

DL subrendimo faktoriai in vivo

Kaip jau buvo minėta ankščiau, tam, kad dendritinė ląstelė galėtų efektyviai aktyvinti naiviuosius T limfocitus, ji turi subręsti. Daugybė veiksnių sužadina ir (arba) reguliuoja dendritinių ląstelių brendimą, įskaitant: a) su patogenais susijusias molekules, pavyzdžiui, LPS [19]; bakterijų DNR [20] ir dvigrandes RNR [21]; b) pusiausvyrą tarp priešuždegiminių ir uždegiminių signalų, esančių lokalioje mikroaplinkoje, įskaitant TNF, IL-1, IL-6, IL-10, TGF-b, ir prostaglandinus; ir c) T ląstelinės kilmės signalus. Brendimo procesas ląstelėse siejamas su tokiais pokyčiais, kaip: endocitinių / fagocitinių receptorių praradimas; padidėjusi kostimuliacinių molekulių CD40, CD58, CD80, CD86 raiška; morfologiniai pokyčiai, pasireiškiantys adhezinių struktūrų praradimu, persitvarkymu citoskelete bei aukštu ląstelės judrumo įgijimu [22]; pokyčiai lizosomų struktūrose: sumažėjusi CD68 ir padidėjusi su dendritinių ląstelių lizosomomis susijusio membraninio baltymo DL-LAMP raiška; ir pokyčiai MHC II molekulėse.

Prie būtinų DL subrendimo faktorių yra priskiriamas atpažinimas įvairių svetimų ir (arba) pavojaus signalų. Tokiais signalais gali būti mikrobinės (svetimas signalas) struktūros, dar žinomos kaip su patogenu susijusios molekulinės struktūros (angl. PAMPs) ir endogeninės viduląstelinės molekulės (pavojaus signalas), vadinamos su pažeidimu susijusiomis molekulinėmis struktūromis (angl. DAMPs). Šios baltyminės arba nebaltyminės kilmės molekulės brendimo agentais tampa tuomet, kai ląstelė nenormaliai dideliais kiekiais savo paviršiuje pradeda sekretuoti tokias medžiagas kaip, pvz., šlapimo rūgštį, ATP, didelio judrumo box 1 grupės baltymą, nuosavą DNR ir RNR, arba kai ląstelės paviršiaus baltymai (pvz., šiluminiai šoko baltymai (Hsps) kaip Hsp70, Hsp90) išskiriami netipiškai.

Imunomoduliacinis dendritinių ląstelių potencialas

DLs, kaip profesionalios antigeną pateikiančios ląstelės (pAPL), po aktyvinimo savo paviršiuje išskiria molekules bei citokinus, kurie nulemia imuninio atsako pobūdį. Iki šiol buvo žinomas DL gebėjimas indukuoti (sužadinti) T ląsteles ir sukelti imuninį atsaką. Tačiau pastaruoju metu literatūroje gausėja duomenų, kad DLs, pateikdamos antigeną T ląstelėms, jas gali veikti dvejopai: imunogeniškai (sukelti imuninį atsaką) arba tolerogeniškai (slopinti imuninį atsaką).

Yra gerai žinoma, kad nesubrendusios dendritinės ląstelės (nDLs) pasižymi tolerogeninėmis savybėmis, nes, sužadindamos reguliacinius T limfocitus, slopina imuninį atsaką [23]. nDLs organizme būdamos ramybės būsenoje (angl. steady-state) palaiko periferinę toleranciją saviems antigenams ir, susidūrusios su vadinamaisiais pavojaus signalais, subręsta, o dėl to vėliau skatina T ląstelių imunogeniškumą [24]. Kiekviena dendritinių ląstelių subpopuliacija pasižymi skirtinga žymenų raiška ir atlieka skirtingas funkcijas (2 pav.), pvz., pDL neturi mDL būdingų žymenų CD13, CD14 ir CD33, bet pasižymi aukšta CD123 [IL-3 receptorius, CD4 ir CD62L žymenų raiška [25, 26]. Ir mieloidinės, ir plazmacitoidinės nesubrendusios dendritinės ląstelės sukelia T ląstelių toleranciją [27, 28]. Nesubrendusių dendritinių ląstelių specializacija – antigenų „gaudymas“, t. y. jos veiksmingai pasisavina patogenus, apoptotines ląsteles ir antigenus iš aplinkos fagocitozės, makropinocitozės arba endocitozės būdu, tačiau jos negali efektyviai apdoroti ir pateikti šių antigenų T ląstelėms [29]. Todėl nDL sukelia T ląstelių anergiją (nejautrą) ar indukuoja reguliacinius T limfocitus [ 30, 31]. 

Kai kurių tyrimų rezultatai rodo, kad skirtingi subrendimo faktoriai suteikia skirtingą subrendimo lygį DLs, kuris toliau lemia skirtingas T ląstelių poliarizacines ar tolerogenines imuninės sistemos funkcijas (4 pav.).

3-1

4 pav. Galimos imuninio atsako kryptys. Priklausomai nuo fagocituotų antigenų bei brendimo sąlygų, dendritinės ląstelės gali sukelti skirtingos poliarizacijos limfocitų populiacijų proliferaciją (modifikuota pagal Katrin Manda, et al., 2012)

Bakterinės kilmės molekulės ar virusinės kilmės produktai (Lipopolisacharidas LPS, dvigrandė RNR (dgRNR), DNR molekulės CpG sritis), uždegiminiai citokinai (naviko nekrozės faktorius TNF-α, interferonas IFN-γ) bei T ląstelių signalai (CD40-ligandas (CD40L)) gali skatinti DLs gaminti IL-12p70 ir IFN- α ir tokiu būdu indukuoti (sužadinti) Th1 T helperių atsaką [32, 33]. Antiuždegiminės molekulės (IL-10, prostaglandinas PGE2 ir kortikosteroidai), priešingai – gali inhibuoti (slopinti) DL subrendimą bei citokinų sekreciją ir dėl to skatinti Th2 T helperių [34–36] ar T reguliacinių limfocitų (Treg) atsaką [37].

Taigi, apibendrinus galima teigti, kad T limfocitų stimuliacijos rezultatą (toleranciją ar imunogeniškumą) lemia ne DL kilmė, bet jų aktyvinimo sąlygos.

DL vaidmuo gydant vėžį ir autoimunines ligas

Dėl savo funkcinio dvilypumo DLs naudojamos terapijoje siekiant sustiprinti nepakankamą imuninį atsaką sergant infekcinėmis ligomis ir vėžiu arba, sukeliant toleranciją, susilpninti pernelyg stiprų imuninį atsaką po organų transplantacijos, sergant alerginėmis ir autoimuninėmis ligomis.

Imunogeniniu potencialu pasižyminčios DLs yra svarbios kuriant gydomąsias vakcinas, kurių paskirtis – stimuliuoti paciento imuninį atsaką, kad būtų atpažintos ir sunaikintos navikinės ląstelės. Įrodyta, kad nekontroliuojamą navikinių ląstelių augimą lemia nepakankamas imuninės sistemos atsakas joms. Norint aktyvinti priešnavikinį imuninį atsaką, reikia skirti imunoterapiją, kurią taikant neretai pavyksta efektyviai sunaikinti pirminius ir antrinius vėžio židinius. 

Imunoterapinės DLs, įsotintų su naviku susijusiais antigenais (angl. TAA), vakcinacijos sėkmė sužadinant apsauginį priešvėžinį atsaką buvo įrodyta ikiklinikiniuose tyrimuose [38, 39, 40]. Šiuo metu vykdomi klinikiniai tyrimai, kuriuose onkologiniams pacientams taikant TAA įsotintas DL pasiekiamas tam tikras imunologinis ir klinikinis atsakas (pvz., T ląstelių proliferacija nustatoma ELISPOT metodu, vertinant IFN-γ sekreciją) be reikšmingo toksiško poveikio [41, 42, 43]. Tačiau, nepaisant to, kad po vakcinacijos daugumos pacientų organizme padaugėja antigenui specifinių T ląstelių, tik nedidelei daliai šių pacientų sukeliamas tinkamas klinikinis atsakas, t. y. naviko regresija ar ilgesnė remisijos trukmė [44, 45]. Iki šiol klinikiniuose tyrimuose, kuriuose buvo naudojamos DL, buvo sulaukta tik vidutinės sėkmės, todėl pastaruoju metu mokslininkai kuria naujas gydymo strategijas, kurios pagerintų DL sukeltą naviko imuninį atsaką. Vienas iš galimų būdų – išnaudoti DL gebėjimą pateikti fagocituotų negyvų navikinių ląstelių peptidus tiek MHC I klasės, tiek ir MHC II klasės molekulėms [46, 47]. Šiuo atveju navikinių ląstelių imunogeniškumas pagerinamas transfekuojant Toll-like receptoriaus (TLR) ligandą. TLR ligandu transfekuotos navikinės ląstelės gali stipriau aktyvinti ir subrandinti DL nei netransfekuotos vėžinės ląstelės [48]. Šie rezultatai dar kartą įrodo, kad siekiant sukurti stabilias visiškai aktyvuotas ir gydymui tinkančias DLs, galinčias sužadinti navikui specifinius citotoksinius T limfocitus (CTL), pasižyminčius ribota ar jokia T reguliacinių limfocitų (Treg) indukcija, reikalingi stiprūs subrendimo signalai. Todėl tokiems tikslams įgyvendinti didelis dėmesys skiriamas patogeninės kilmės molekulių panaudojimui DL subręsti [49, 50, 51]. Navikų vakcinacijos strategijoje TLR ligandų panaudojimas DLs leidžia pajusti „pavojų“, dėl kurio jos tampa visiškai subrendusiomis imunostimuliacinėmis DLs. Neseniai vieni autoriai savo darbuose parodė, kad stimuliuojant polyinozino polycytidino rūgštimi poly(I:C) dendritinių ląstelių TLR3 galima pralaužti tolerogenines DL funkcijas [52]. 

Dendritinių ląstelių vaidmuo svarbus ir autoimuninių ligų patologijoje, nes nuo DL funkcinių savybių gali priklausyti, ar imuninė reakcija vystysis citotoksiškumo ar tolerancijos linkme. Imuninio toleravimo procese dalyvauja DL sekrecijos produktai – citokinai. Vieni autoriai eksperimentiniame darbe su pelėmis pažymi, kad dendritinės ląstelės gali indukuoti (sužadinti) CD4+CD25+ T ląsteles (Treg), kurios slopina autoimunines ligas in vivo [53]. Šios reguliacinės ląstelės nenutukusiose diabetinėse pelėse (NOD) slopina diabeto vystymąsi [54, 55]. Šis faktas galėtų būti pritaikomas kuriant antigenui-specifinę terapiją prieš autoimuninius susirgimus. 

Kaip buvo minėta anksčiau, citokinai yra svarbūs autoimuninio proceso mediatoriai (tarpininkai). Dendritinės ląstelės pačios išskirdamos citokinus jiems yra jautrios, nes citokinai turi įtakos DL subrendimui (diferenciacijai iš nesubrendusių į subrendusias DL). Kontroliuodami dendritinių ląstelių brendimą, citokinai reguliuoja imuninę homeostazę bei tolerogeniškumo ir imunogeniškumo balansą. Padidėjusi citokinų sekrecija keičia DL homeostazę taip darydama įtaką įvairioms žmogaus uždegiminėms ir autoimuninėms ligoms; pvz., citokino IL-6 padidėja serume vaikų, sergančių sisteminiu jaunatviniu artritu [56]; užblokavus specifiniais antikūnais aktyvia Krono (Crohn) liga sergančių pacientų IL-12, pasiekiama stabili ligos remisija [57]; IL-23 turi įtakos psoriazei ir uždegiminėms žarnyno ligoms [58, 59]; citokino TNF blokada yra teisiškai pripažinta ir efektyvi gydant reumatoidinį artritą (RA), psoriazę [60, 61]. DL homeostazės pokyčiai tiesiogiai susiję su tokiomis žmogaus autoimuninėmis ligomis kaip I tipo diabetas, išsėtinė sklerozė bei sisteminė raudonoji vilkligė (SLE) [62, 63].

Priešvėžinės DL vakcinos

Pagrindiniai vėžiu sergančių pacientų gydymo metodai yra chirurginis, spindulinis bei medikamentinis. Tačiau, nors šie metodai ir tobulėja, vėžys lieka viena pagrindinių sergamumo bei mirtingumo priežasčių pasaulyje. Ieškoma naujesnių, efektyvesnių vėžio gydymo būdų. Vienas iš šiuo metu plačiai tyrinėjamų – vėžio imunoterapija. Nespecifinė imunoterapija (pvz., citokinų imunoterapija, BCŽ vakcinacija) onkologijoje pradėta naudoti jau prieš kelis dešimtmečius. Pastaruoju metu vis didesnis dėmesys skiriamas specifinei ląstelinei priešnavikinei imunoterapijai, kuri gali būti aktyvi (vakcinacija dendritinėmis ląstelėmis) ir pasyvi (aktyvintų T limfocitų skyrimas). Viena perspektyviausių krypčių yra gydomoji vakcinacija dendritinėmis ląstelėmis (DLs), kurios paskirtis – kovoti su organizme jau esančiu vėžiu aktyvinant imuninį atsaką piktybinėms ląstelėms. Gydomoji DL vakcinacija vis plačiau taikoma įvairiose pasaulio klinikose. Klinikinis atsakas į gydymą DL pasiekiamas apie 54 % pacientų. Šiuo metu yra naudojama FDA (angl. Food and Drug Administration) patvirtinta pirmoji ląstelių pagrindu sukurta priešvėžinė vakcina – „Dendreon“ firmos ProvengeR vakcina. Ši autologiniais antigenais įsotinta priešvėžinė DL vakcina yra skirta sergantiesiems metastazavusiu prostatos vėžiu. Atlikus randomizuotą III fazės klinikinį tyrimą buvo gauta, kad bendras šių pacientų išgyvenimas vidutiniškai pailgėja daugiau nei 4 mėnesius, palyginti su placebo vakcina. Akivaizdu, kad dendritinių ląstelių imunoterapija, kaip ir kiti šiuolaikinio gydymo metodai, efektyviausia tada, kai ji individualizuojama, t. y. skiriama atsižvelgiant į konkretaus paciento organizmo savybes.

Gydomosios autologinės dendritinių ląstelių vakcinos gaminamos individualiai kiekvienam pacientui. Tam tikslui naudojami paciento naviko mėginiai (lizatas, peptidai ar kiti modifikuoti produktai) bei iš kraujo išskirti monocitai, kurie ex vivo priverčiami diferencijuotis į dendritines ląsteles ir subrandinimui įsotinami naviko antigenais. Taip paruoštos ir atgal suleistos į sergančio paciento organizmą, dendritinės ląstelės sugeba aktyvinti organizmo imuninį atsaką kovai su vėžinėmis ląstelėmis (5 pav.).

4-1

5 pav. Autologinės DL vakcinacijos schema. 

Šiuo metu vakciną sudarančių dendritinių ląstelių subrendimas ir aktyvinimas apibūdinami nustatant konkrečių žymenų raišką (CD80, CD83, CD86, HLA-DR, CD11b). Tačiau paskutiniu metu gausėja duomenų, kad vien tik minėtų žymenų raiškos nustatymas pagamintose DL vakcinose gali būti apgaulingas, nes dalis DL gali ekspresuoti ir ligandus, per kuriuos slopinamas priešnavikinių T limfocitų atsakas (CD273, CD274, CD58k). Remiantis paskutiniais DL biologijos tyrimų rezultatais, tikslinga nuodugniau ištirti DL funkcines savybes.

Gydymas dendritinėmis ląstelėmis, kaip ir kiti gydymai, turi būti standartizuojamas. Standartizuojami turi būti šie kriterijai: DL paruošimo būdas, DL tipas, DL subrendimo ir aktyvavimo būklė, laiko intervalas ir dozė, gydymo kursas ir antigeno pakrovimo būdas. Pirmuose paskelbtuose eksperimentiniuose darbuose buvo pastebėta nemažai trūkumų (per mažai paaiškinimų, trūkumai tyrimo planavime). Daugelyje tyrimų yra per mažai informacijos apie DL vakcinų kokybės kontrolę, DL fenotipo skirtumus tarp atskirų pacientų, klinikinį atsaką, kuris vertinamas neatsižvelgiant į specifinius bei gerai apibrėžtus, visuotinai pripažintus naviko atsako kodavimo kriterijus. Šias atsako vertinimo schemas gerai aprašo Pasaulinės sveikatos organizacijos (PSO) ir atsako kietuose navikuose (RECIST) kriterijai, kurie leidžia objektyviai įvertinti navikinį atsaką. Vieni autoriai [64], planuodami klinikines studijas su DLs vakcinomis, siūlo vadovautis šiais minimaliais klinikiniais ir imunologiniais kokybės kriterijais: (1) paciento charakteristika (klinikinė stadija tyrimo įtraukimo metu, ankstesnis gydymas, duomenys apie ligos progresavimą); (2) tyrimo plano aprašymas (tyrimo pradžios / pabaigos datos, pacientų atranka, gydymo kursas, DL skaičius, vakcinacijos grafikas, mėginių ėmimo laikas); (3) aiški klinikinio atsako dokumentacija; (4) visų pacientų klinikinio efekto aprašymas (norint įvertinti tyrimo rezultatus, pacientai turi būti stebimi pakankamai ilgą laiko tarpą); (5) imunologinių matavimų prieš ir po vakcinacijos aprašymas (antigenui specifinių T limfocitų buvimas, antikūnų titrai (jei taikomi), navikinių ląstelių antigeno ekspresija); (6) siūlomi tyrimai (antigenui specifinių CD4+ ir CD8+ T-limfocitų skaičius periferiniame kraujyje; uždelsto tipo padidėjusio jautrumo biopsijos; fenotipinė analizė (įskaitant tetramerų analizę); funkcinė analizė (ELISPOT, citokinų gamyba ar citotoksiškumas); T limfocitų receptorių paletės analizė; antigenui specifinių antikūnų titrų matavimas serume). Tyrimuose, kuriuose yra vertinamas DL vakcinų poveikis, turėtų būti įtraukta informacija apie DL subrendimą bei aktyvavimą, taip pat kaip ir kokybės kontrolė. Tie patys autoriai [64] pateikia keletą nesubrendusių ir subrendusių DL fenotipo bei funkcinių kokybės kriterijų: 

Būtinieji kriterijai: mikrobiologinė kontrolė (neigiama bakterijų ir grybelinė tarša); grynumas (>80 % taikant tėkmės citometrijos metodą); morfologija (nesubrendusios DL – silpnai adherentinės, plaukiojančios, apvalokos ląstelės su tam tikrais išsišakojimais; subrendusios DL – silpnai prisitvirtinusios, susitelkusios ląstelės); fenotipas: monocitų kilmės DL žymenys: nesubrendusių DL (CD14–/loCD83–CD80–/loCD86loMHC I+MHC II+ CCR5+); subrendusių DL (CD83+CD80+CD86+MHC I + MHC II +CCR7+); DL, kilusių iš CD34+ ląstelių, žymenys: intersticinės DL (CD14+CD1a+/–CD83+CD80+CD86+MHC I+MHC II+); Langerhanso ląstelės (CD14–CD1a+CD83+CD80+CD86+MHC I+ MHC II+); gyvybingumas (>70 % gyvų ląstelių nustatoma Tripano mėlio išmetimo testu).

Papildomi patikros kriterijai: DL fenotipo stabilumas (nustatomas po vienos ar dviejų dienų kultivavimo terpėje su ar be citokinų. „Išplovimo testas“: DL privalo išlikti gyvybingos ir išlaikyti joms būdingą morfologiją bei fenotipą po dviejų dienų terpėje be citokinų (visiškai subrendusių ir stabilių DL charakteristika); imuninio atsako sužadinimas: mišri limfocitų reakcija – kultivuojant DL ir PKVL (periferinio kraujo vienbranduolės ląstelės) santykiu 1:20 (vieno donoro), matuojama T ląstelių proliferacija); antigeno įsotinimo atpažinimas T ląstelėmis – vertinami citokinai arba atliekamas citotoksiškumo testas (ypač svarbu, kai įsotinimas antigenu vyksta prieš užšaldymo procedūrą); įsotinimo antigenu būsenos vertinimas (galimas tuomet, kai DLs yra įsotintos gerai charakterizuotais antigenais (pvz., peptidais, baltymais ar RNR); antigenui specifinės stimuliacijos testas – vertinamas antigenu įsotintų DL gebėjimas stimuliuoti antigenui specifines T ląsteles. 

Taigi, norint pasiekti maksimalų klinikinį gydomąjį vakcinacijos efektą onkologiniams pacientams, gautą DL preparatą būtina detaliai charakterizuoti ir atlikti griežtą kokybės kontrolę.

DLs išskyrimas iš periferinio kraujo vienbranduolių ląstelių (PKVL)

Dendritinių ląstelių vakcinoms ruošti reikalingos nesubrendusios dendritinės ląstelės, kurios ex vivo aktyvinamos ir įsotinamos navikiniais antigenais. Nesubrendusios DLs gali būti gaunamos:

1) iš kraujo išskiriant monocitus ir ex vivo juos diferencijuojant į nDLs, 2) išskiriant kraujyje cirkuliuojančias natūralias DLs. Naujausi eksperimentiniai tyrimai suteikia vilčių, kad ateityje DLs galima bus gaminti iš in vitro moduliuotų kamieninių ląstelių [72], tačiau tokie metodai praktikoje dar netaikomi.

Šiuo metu daugumoje eksperimentinių ir klinikinių studijų naudojamos in vitro sąlygomis išaugintos DLs, kurios yra kilusios iš progenitorinių CD34+ ląstelių ar kraujo monocitų [67, 68]. Dažniausiai nesubrendusios DLs gaunamos ex vivo iš monocitų, išskirtų iš paciento periferinio kraujo vienbranduolių ląstelių frakcijos (PKVL) [69]. Monocitai, naudojant citokinus GM-CSF ir IL-4, per 5–7 dienas diferencijuojasi į nesubrendusias dendritines ląsteles. Norint gauti visiškai subrendusias, pasižyminčias stipriomis stimuliacinėmis savybėmis DLs, nesubrendusios DLs toliau turi būti dar 2–3 dienas aktyvinamos mikrobinės, uždegiminės ar T ląstelinės kilmės faktoriais.

Kraujyje cirkuliuojančių DL yra labai mažai (sveikų žmonių PBMC sudaro nuo 0,5–1 %, o onkologiniai pacientai, ypač su išplitusia liga, jų turi dar mažiau [65], todėl labai sunku surinkti pakankamą ląstelių skaičių. Siekiant pagausinti DL populiaciją in vivo ir padidinti gaunamų ląstelių išeigą, naudojami hemopoetiniai augimo faktoriai (Flt-3 ligandas, GM-CSF) [66]. Dėl didelės minėtų faktorių kainos, šis metodas nėra plačiai taikomas. Natūralios DLs gali būti tiesiogiai išskirtos iš periferinio kraujo arba iš leukaferezės produktų imunomagnetinio atskyrimo būdu [70, 71, 73]. Tuomet izoliuotos DL įsotinamos navikiniais antigenais, subrandinamos ir suleidžiamos atgal pacientui. Kadangi šios ląstelės yra natūralios kilmės, savo kokybe jos gali lenkti iš CD34+ pirmtakų ar iš monocitų gautas ex vivo DLs. Yra duomenų, kad šviežiai izoliuotos DLs geriau sužadina antigenui specifinį Th1 tipo atsaką negu kilusios iš monocitų DLs [74]. 

Onkologiniams pacientams dėl mažo natūralių DL kiekio gali būti sudėtinga izoliuoti pakankamą jų kiekį vakcinos gamybai. Be to, onkologinių pacientų kraujo DLs imunogeniškumas gali būti funkciškai naviko nuslopintas [65, 75, 76]. Naviko imunosupresinis poveikis monocitams nenustatytas, todėl monocitai tampa tinkamiausiu objektu DL vakcinų ex vivo gamybai [70, 65]. Labai svarbu, kad subrendusios, iš monocitų ex vivo pagamintos DLs yra atsparios sisteminiam navikinės kilmės slopinančiam signalui [77, 35, 33].

DL įsotinimas naviko antigenais ex vivo būdu

Pagrindinis vakcinacijos nuo vėžio tikslas – sukelti stiprų citotoksinių T limfocitų, naikinančių navikines ląsteles ir plėtojančių ilgalaikės atminties atsaką, kuris padėtų išvengti vėžio atsinaujinimo. Šis vakcinacijos būdas yra saugus, gerai toleruojamas, skatinantis ląstelinį imuninį atsaką bei navikui specifinių CD4+ ir CD8+ T limfocitų proliferaciją. Tačiau daugumai pacientų efektyvus klinikinis atsakas dar nepasiekiamas [78]. 

Efektyvių priešvėžinių DLs vakcinų paruošimo svarbiausias momentas – jų įsotinimas naviko antigenais. Istoriškai pirmosios DLs vakcinos buvo ruošiamos, neišskiriant monocitų diferenciacijos ir brandinimo etapų. Monocitai ex vivo būdu buvo įsotinami antigenu kartu su diferenciacijai skirtais citokinais GM-CSF ir IL-4. Vėlesniuose vakcinų ruošimo protokoluose šie etapai buvo išskirti, ypač didelį dėmesį skiriant naviko antigeno įsotinimo metodams. 

Vakcinacijos efektyvumui įtakos gali turėti antigeno, reikalingo DL įsotinimui, pasirinkimas. Daugiausia naudojami dviejų tipų antigenai: mutavę (unikalūs) ir nemutavę (universalūs). Naudojant mutavusius antigenus, gydymas turi būti individualizuojamas. Kaip pavyzdys galėtų būti idiotipu įsotintos DLs. Idiotipą sudaro kiekvieno individo imunoglobulinų determinantų antigenų derinys. Šis DL įsotinimo antigenais būdas buvo įvertintas III fazės klinikinio tyrimo metu folikuline limfoma sergantiems pacientams, kuriems gerokai prailgėjo ligos remisijos periodas [83]. Tačiau daugybinės mielomos atveju tokie dėsningumai nebuvo patvirtinti [84]. Kaip alternatyva, daugiausia taikomoms vakcinoms plėtoti, galėtų būti naudojami universalūs, nemutavę, antigenai, tik šių vakcinų veiksmingumą gali susilpninti jau esantys Treg limfocitai [82].

Šiuo metu yra taikomi keli in vitro navikinių antigenų pateikimo dendritinėms ląstelėms būdai. Vienas iš paprasčiausių ir plačiausiai naudojamų yra autologinio naviko arba alogeninių navikinių ląstelių mišinio lizatai. Šio metodo pranašumas – pateikiamas realus naviko antigenų spektras, tačiau autologiniai antigenai gali sukelti nepakankamą T limfocitų stimuliaciją.

Tam tikrų standartizuotų naviko antigenų mRNR transfekcija arba įsotinimas elektroporacijos būdu yra labai perspektyvūs, tačiau kol kas nėra pakankamai standartizuoti rekomenduojami navikų antigenų deriniai pagal onkologinių ligų nozologijas [79]. Šis metodas yra toliau pažengęs tik vakcinų prieš melanomą srityje.

Ex vivo būdu išaugintų DLs gebėjimas moduliuoti aktyvintų T limfocitų migraciją į naviką priklauso nuo paruošimo metodikų ir dažnai yra nepakankamas [80, 81]. Natūraliai DLs T limfocitus aktyvuoja ne tik pateikdamos svetimus antigenus. DLs, kaip profesionalios APC, papildomai aktyvina T limfocitus per kostimuliacinius receptorius ir suteikia jiems poliarizacijos bei „homingo“ signalus. In vitro paruoštų DLs sugebėjimą papildomai stimuliuoti ir nukreipti T limfocitus didina naudojami įvairūs faktoriai (adjuvantai), kurie formuoja stiprų imuninį atsaką [79]. Adjuvantais gali būti naudojami aliuminio druskos, citokinai, bakteriniai produktai (peptidai, negyvų bakterijų kiautai), nanodalelės.

DL brandinimas in vitro

DL brandinti yra naudojamos kelios strategijos, kurios pasižymi aukštu imuninių ląstelių aktyvavimo potencialu. Nesubrendusioms DL brandinti yra naudojami tokie faktoriai kaip lipopolysacharidas (LPS), CD40 ligandas (CD40L), naviko nekrozės faktorius-α (TNF-α), IFN-α ir IFN-γ. Norint imituoti uždegimo aplinką, naudojami brandinimo kokteiliai su keliais faktoriais: prostaglandinas E2 (PGE2), interleukinas-1β (IL-1β), IL-6 ir polyinozinas: polycytidino rūgštis (poly (I:C)). Yra išskiriami trys pagrindiniai DL brandinimo protokolai: LPS, CD40L/TNF-α ir nuo IFN priklausomas.

LPS

Dėl savo bakterinės kilmės LPS yra pristatomas kaip tipiškas DL brandinimo modelis. Genų profilio studijos pademonstravo, kad LPS gali sužadinti keletą chemokinų genų: CCL5 (RANTES), CCL4 (MIP-1β), CCL20, CCL18 (DC-CK1), CCL19 (MIP-3β), ir CCL23 (MPIF-1) [85, 86, 87]. Genų CCL5, CCL4, CCL20, CCL18 raiška taip pat buvo patvirtinta RT-PCR ar ELISA metodais [88, 89] [90, 91].

Chemokinas CCL5 tarpininkauja ne tik monocitų ir T ląstelių „homingo“ (grįžimo namo) procese, bet veikia ir kitas chemokino receptorių (CCR)-5 ekspresuojančias ląsteles – bazofilus, eozinofilus, natūralius kilerius (NK), DLs ir putliąsias ląsteles [92]. Padidėjusi CCL5 raiška yra susijusi su įvairiomis uždegiminėmis ligomis bei patologijomis. CCL4 pasižymi chemotaktinėmis (pritraukiančiomis) ir uždegimą skatinančiomis savybėmis, į uždegimo vietą pritraukiantis monocitus [93]. CCL20 sąveikauja su CCR-6, sutelkia nesubrendusias DLs bei jų pirmtakus ir NKT ląsteles [94]. Chemokinai CCL18 ir CCL23 gali pritraukti limfocitus, nesubrendusias DLs ir monocitus. Išlieka neaišku, ar CCL18 palaiko uždegimą skatinantį (Th1) ar uždegimą slopinantį / tolerogeninį (Th2) atsaką, priklausomai nuo mikroaplinkos, kurioje jis sekretuojamas [95].

Kitas dažnai tyrinėjamas transkriptas, kuris gali būti sužadintas LPS subrandintų DL, – su BCL susijęs A1 (BCL2A1) baltymas, kuris, kaip ir BCL-2, pasižymi antiapoptotinėmis savybėmis [96]. Jis skatina imuninių ląstelių išgyvenamumą ir formuoja stipresnį imuninį atsaką [95]. Visi šie faktai rodo, kad LPS sukelti DLs stimuliaciniai signalai pagerina įvairių imuninės sistemos ląstelių sutelkimą ir aktyvina pirminį imuninį atsaką.

 TNF-α/CD40L

TNF-α/CD40L sužadina tų genų grupių raišką, kurios yra glaudžiai susijusios su TNF šeimos signaliniais keliais: CCL17 (TARC), IL-10R, IL-13R, MYO1A ir GM-CSFR [97, 98, 99, 100]. CCL17 yra chemokinas, sutelkiantis atminties DLs, CD4+ limfocitus ir Th2-T ląsteles. Didelis CCL17 kiekis melanoma sergančių pacientų serume siejamas su išgyvenamumu iki ligos progresavimo kaip atsakas į DL imunoterapiją [101]. Citokinų receptoriai IL-10R ir IL-13R dalyvauja Th2 ląstelių diferenciacijoje [102], daro DLs jautresnes Th2-citokinų pusiausvyrai kai kurių navikų mikroaplinkoje [103] ir taip susilpnina imunogenines DL savybes. TNF-α/CD40L subrandintų DL transkripcinis profilis rodo, kad šios DLs nukreipia T ląsteles link Th2 atsako [103]. TNF-α-subrandintos DLs pasižymi mažesne IL-12 ir IFN-γ sekrecija, taigi ir mažesniu nei LPS gebėjimu aktyvinti citotoksinių T limfocitų atsaką in vitro [103].

IFNs

IFN vaidmuo yra plačiai ištirtas inicijuojant įgimtą bei įgytą imuninį atsaką in vivo bei in vitro DLs brandinimo protokoluose [104, 105]. Tačiau fiziologinė IFN reikšmė DL funkcijoms in vivo iki šiol išlieka neaiški. Nustatyta, kad IFN-α sužadina DL diferenciaciją in vitro, o IFN-γ, naudojamas vienas ar mišinyje su kitomis medžiagomis, padeda DL subręsti. IFN subrandintos DLs išskiria didelius kiekius citokino IL-12 [106, 107].

Citokinų brandinimo kokteiliai

Bandydami atkurti fiziologinę DL subrendimo aplinką, dauguma tyrėjų pasisako už subalansuotus brandinimo kokteilius.

Dažniausiai naudojamus brandinimo kokteilius sudaro TNF-α, IL-1β, IL-6 ir PGE2. Šio kokteilio paskirtis – imituoti  uždegimo aplinką, kurioje DLs subręsta fiziologiškai. Įdomu pažymėti, kad LPS subrandintų DL genų raiškos profilis labai skiriasi nuo šiuo kokteiliu subrandintų DL genų raiškos. Šiuo brandinimo kokteiliu, kaip ir brandinant vien tik TNF-α, sužadinama CCL17, CXCR4 ir IL13R genų raiška, bet nebūna IL10R ir GMCSFR genų raiškos [108]. Naudojant minėtąjį brandinimo kokteilį, padidėja ir kitų genų raiška: NF-kB1/2, CXCL-2/GRO-β, TNFAIP3/6, CXCL-8/IL-8, CXCL-16, CD58, IL-2R, IL-7R, CRIP1, ISG20, BCL2A1, IER3, CFLAR, NCK2 ir RUNX3 [108]. Šių genų funkcija yra susijusi su uždegimą skatinančių atsaku ir apoptoze. In vitro tyrimai parodė, kad šiuo kokteiliu subrandintos DLs ypač stipriai stimuliuoja limfocitų proliferaciją [109, 110].

PGE2 naudojimas brandinimo kokteiliuose yra kontroversiškas. Nors šio faktoriaus vaidmuo uždegimo metu yra neabejotinas, tačiau jis tiesiogiai stimuliuoja T reguliacinių proliferaciją bei TGF ir efektorinių T limfocitų apoptozę [111]. Tokiu būdu PGE2 aplinkoje bręsdamos DLs gali suaktyvinti tolerogeninį imuninį atsaką [108, 112, 113]. Kelių klinikinių studijų metu buvo nustatyta, kad metastazavusia melanoma ir inkstų ląstelių karcinoma sergančių pacientų, gydytų šiuo kokteiliu brandintomis DLs, plazmoje padaugėjo ir Th1, ir Th2 profilio citokinų [114, 115, 116]. Dėl šios priežasties buvo pasiūlyta DL brandinimo kokteiliuose atsisakyti PGE2.

Kaip alternatyva prieš tai minėtam kokteiliui, siūlomas kitas brandinimo kokteilis: IL-1β, TNF-α, IFN-α, IFN-γ ir poly (I:C). Šis brandinimo protokolas DL brendimą nukreipia Th1 atsako formavimosi kryptimi, nes IL-12p40, IL-1α/β, IL-2Rα/β/γ, IL-6, CXCL-8/IL-8, IL-15, CXCL-9/Mig, CXCL-10/IP10 bei CXCL-11 sekretuojami gerokai didesniais kiekiais, negu naudojant brandinimo kokteilį su PGE2- [108].

Trečias galimas brandinimo kokteilis, kurio sudėtyje nėra PGE2, yra LPS ir IFN-γ [117]. Atlikus šiuo kokteiliu subrandintų DL genų raiškos analizę buvo nustatyti kai kurie uždegimą sukeliantys citokinai, chemokinai bei su uždegimu susiję genai. Padidėjusi faktorių CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL8, CXCL-9, CXCL-10, CXCL-11, IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, TNF, DUSP5 ir SOD2 raiška buvo aptikta 24 valandas brandintų LPS ir IFN-α DL supernatante, kas rodė stiprų Th1 poliarizacijos potencialą [117]. Tyrimai in vitro parodė, kad LPS ir IFN-γ subrandintos DLs antigenui specifines CD4+ ir CD8+ T ląsteles stimuliuoja žymiai geriau negu PGE2 subrandintos DLs [118].

Naviko mikroaplinka (NMA) ir DL

Nepaisant to, kad daugeliui pacientų navikui specifinis T ląstelių atsakas sužadinamas, tačiau terapinis DL vakcinų poveikis nėra ilgalaikis. Viena iš priežasčių – imunines reakcijas slopinantis naviko mikroapolinkos poveikis. Norint geriau suprasti, kaip navikas aplink esančias ląsteles panaudoja savo pabėgimui nuo imuninės sistemos, reikia detaliau patyrinėti naviko mikroaplinką. Naviką sudaro ne tik vėžinės ląstelės. Naviko egzistavimui labai svarbu sukurti apie save tam tikrą mikroaplinką, užtikrinančią jam mitybą bei sparčiam ląstelių augimui visus reikalingus faktorius. Augdamas navikas apie save formuoja jungiamąjį audinį, kraujagyslių bei imuninį barjerą sudarančių ląstelių tinklą. Šioje aplinkoje esantys fibroblastai, makrofagai, limfocitai, dendritinės ląstelės dėl naviko išskiriamų citokinų bei fermentų sukelia stiprų imunines reakcijas slopinantį barjerą. Naviko mikroaplinkos ląstelių sukeliami pronavikiniai mechanizmai slopina ir ex vivo paruoštų priešvėžinių dendritinių ląstelių vakcinų efektyvumą (6 pav.).

4-1

6 pav. Imunosupresinis naviko mikroaplinkos mechanizmų poveikis DL priešnavikiniam imuniniam atsakui.

T limfocitai efektoriai, aktyvinti imunogeninių DL, turėtų atpažinti ir sunaikinti navikines ląsteles. Tačiau imunosupresinių Treg, MDSCs bei navikinių ląstelių sekretuojami citokinai TGF – β, IL – 10 ir aliarminai, gali išreguliuoti DL funkcijas ir apriboti T limfocitų efektorių funkcijas. 

(A) Naviko antigenai turėtų sukelti imunogeninių DL brendimą, kurios aktyvinimo metu išskirtų didelius kiekius IL – 12. IL – 12 sustiprina NK ląstelių ir Th1 efektorių citotoksinį aktyvumą bei stimuliuoja T ir NK ląstelių išskiriamų citokinų (interferono –gama IFN – γ ir naviko nekrozės faktoriaus – alfa TNF – α) gamybą. 

(B) Naviko bei jo aplinkos supresinių ląstelių ( II tipo su naviku susiję makrofagai M2, mieloidinės kilmės supresinės ląstelės MDSC ir T reg) išskiriami aliarminai TSLP, EDN ir MMP-2 aktyvina uždegiminių DLs formavimąsi ir Th2 limfocitų poliarizaciją. 

(C) Naviko bei jo aplinkos supresinių ląstelių išskiriami imunosupresiniai citokinai IL – 10 ir TGF – β stimuliuoja nesubrendusių / tolerogeninių / imunosupresinių DLs formavimąsi ir viso priešnavikinio imuninio atsako slopinimą.

 Imunosupresinės molekulės

Kai kurie naviko išskiriami citokinai ir fermentai (IDO/TDO, CCL-2, VEGF, TGF-b, M-CSF, GM-CSF, IL-6, IL-10) neigiamai veikia DL funkcijas. Navikinių ląstelių išskiriamas TGF-b gali skatinti nesubrendusių DLs tolerogenines funkcijas, stimuliuoti T reguliacinių ląstelių, mieloidinės kilmės supresinių ląstelių (MDSC) bei M2 makrofagų kaupimąsi naviko mikroaplinkoje [119]. Citokinai IL-6 ir M-CSF keičia monocitų diferenciaciją: monocitai diferencijuojasi į makrofagus, o ne į DLs [120]. IL-10 transformuoja imunostimuliacines DLs į tolerogenines antigeną pateikiančias ląsteles bei slopina efektorinius T limfocitus, stimuliuodamas, anerginius (neaktyvius) CD8+ T limfocitų klonus [121], aktyvina navikinėse ląstelėse Stats, MAPK, β-catenin signalinius kelius [122]. Chemokinas CCL2, pritraukdamas uždegiminius monocitus ir II tipo makrofagus M2, skatina navikinę angiogenezę bei Treg aktyvumą [123, 124].

Reguliacinės T ląstelės (Treg)

CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg yra CD4 T ląstelių subpopuliacija, kuri slopina imuninį atsaką. Žmonių CD4+ ląstelėse Treg būna nuo 5–15 %. CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg limfocitai palaiko supresinę aplinką ir slopina priešnavikinį imuninį atsaką. Jie sekretuoja inhibitorinius (slopinančius) receptorius CTLA-4, PD-1 ir Tim-3, pasižyminčius supresinėmis savybėmis [125]. Kai kurie tyrimai rodo, kad Treg per CTLA-4 gali sukelti DL kostimuliacinių molekulių (CD80, CD86) raiškos sumažėjimą [126], be to, sekretuodami du pagrindinius imunosupresinius citokinus IL-10 ir TGF-b, slopinti tiek specifinių efektorinių T limfocitų, tiek įgimto imuniteto NK ląstelių aktyvumą.

Mieloidinės kilmės supresinės ląstelės (MDSCs)

Palyginti neseniai identifikuotos MDSCs – dar viena imunosupresinių vėžio mikroaplinkos ląstelių populiacija. Mieloidinės kilmės supresinės ląstelės MDSCs slopina CD8+ T ląstelių priešnavikinį imunitetą [127, 128] ir sužadina Treg ląstelių proliferaciją [129]. Šios ląstelės ne tik sekretuoja imunosupresinį citokiną IL-10, bet taip pat dideliais kiekiais išskiria ARG1 ir NOS, fermentus skaidančius T limfocitams būtiną amino rūgštį argininą. Tokiu būdu yra blokuojamas signalų perdavimas per TCR receptorių, sukeliama efektorinių T limfocitų apoptozė, slopinamas IFN- γ išsiskyrimas [130, 131, 132]. Aviko mikroaplinkoje MDSC išskiriamų citokinų ir fermentų fone susikaupia M2 makrofagai, kurie, išskirdami didelius imunosupresinių citokinų (IL-10, TGF- β, VEGF) kiekius, taip pat aktyviai palaiko imunosupresiją. [133, 134, 135].

Th2 ląstelės ir aliarminai

Aliarminai yra natūraliai aptinkami endogeniniai mediatoriai, kuriuos išskiria daugelis tipų ląstelių, reaguodamos į infekciją ir (arba) į kai kurių ląstelių tipų audinių sužalojimą. Šių „pavojaus signalų“ funkcija – aktyvuojant ir sutelkiant įgimto ir įgyto imuniteto efektorines ląsteles, įspėti šeimininko imuninę sistemą apie ląstelių ar audinių traumą [136]. Navikinės ląstelės taip pat sugeba išskirti aliarminus, o DLs paviršiaus bei viduląsteliniais receptoriais sugeba juos pajusti. Šie mikroaplinkos aliarminai keičia DLS poliarizaciją iš imunogeninės į uždegiminę, sukeliančią Th2 limfocitų formavimąsi ir priešnavikinių reakcijų slopinimą.

Matrikso metaloproteinazę 2 (MMP-2) išskiria vėžio ir (arba) stromos ląstelės ir padidėjusi jų sekrecija siejama su prastesne išgyvenamumo prognoze [137, 138]. Tai siejama su MMP-2 poveikiu DLs inicijuoti uždegimines reakcijas Th2 kryptimi. 

Čiobrialiaukės stromos limfopoetinas (TSLP) taip pat aprašomas kaip vienas iš DL funkcijų reguliatorius bei Th2 atsako iniciatorius [139]. Buvo įrodyta, kad navikinių ląstelių gaminamas TSLP gali stimuliuoti Th2 ląsteles, kurios, išskirdamos IL-3 ir IL- 4, skatina kasos vėžio bei krūties vėžio naviko augimą [140, 141]. 

Kitas aliarminas – eozinofilinės kilmės neurotoksinas (EDN) – dendritinėse ląstelėse aktyvina TLR2 MyD88 signalinį kelią ir taip pat sustiprina Th2 imuninį atsaką [142].

Inhibitorinių (slopinančių) receptorių ekspresija

Slopinantys receptoriai CTLA-4, PD-1, Tim-3, LAG3, ICOSL, GITR1 ir B7H3, reguliuojantys imuninį atsaką, užtikrina imuninę toleranciją ir apsaugo nuo autoimuninių susirgimų. Su citotoksiniais T limfocitais susijusį antigeną 4 (CTLA-4), programuotos ląstelių žūties baltymą 1 (PD-1) bei T ląstelių membranų baltymą 3 (Tim-3) dideliais kiekiais ekspresuoja T reg ląstelės, aktyvinti efektoriniai CD8+ T limfocitai. CD47, SIRPα ligandas, vadinamas „nevalgyk manęs“ signalu fagocitinėms ląstelėms, kurių funkcija blokuoti fagocitozę. Didelė CD47 raiška žmogaus navikinėse ląstelėse parodo kitą naviko pabėgimo nuo imuninės sistemos mechanizmą. Šiuo būdu navikinės ląstelės išvengia fagocitozės ir sunaikinimo [143]. Pastarieji duomenys rodo, kad šio mechanizmo blokavimas neutralizuojančiais antikūnais gali slopinti migracijos ir metastazavimo procesus įvairiuose navikiniuose modeliuose.

Taikininė NMA terapija

Vienas iš daug žadančių būdų, kaip efektyviai suaktyvinti terapinį priešnavikinį imunitetą, yra tam tikrų navikui gyvybiškai svarbių molekulių blokavimas. Pirmasis įrodymas, kad tokios molekulės blokada sustiprina priešnavikinį atsaką, buvo CTLA-4 blokavimas [144]. CTLA-4 yra homologas CD28, kuris jungdamasis prie savo CD80 ir CD86 ligandų, aktyvina CTLA-4 ekspresuojančių T ląstelių slopinančius signalus. CTLA-4 blokada neutralizuojančiais antikūnais (Ipilimumabu ir Tremelimumabu) veikia ir efektorines, ir reguliatorines Treg ląsteles, sustiprina imuninį atsaką ir parodo perspektyvų klinikinį atsaką melanoma sergančiuose pacientuose [145]. Neseniai Amerikos maisto ir vaistų administracija, FDA (angl. Food and Drug Administration), remdamasi teigiamais ipilimumabu gydytų pacientų rezultatais, ši antikūną patvirtino kaip preparatą neoperabiliai ar metastazavusiai melanomai gydyti [146]. Anti-CTLA-4 efektyvumas šiuo metu tiriamas ir kitų vėžinių susirgimų gydymui.

PD-L1 (PD-1 ligandą) ekspresuoja įvairios naviko mikroaplinką infiltruojančios ląstelės, tarp jų ir DLs. Užblokavus PD-L1, sukeliama ilgalaikė naviko regresija bei ilgai trunkanti ligos stabilizacija pacientams su išplitusiu vėžiu, tarp jų su nesmulkialąsteliniu plaučių vėžiu, melanoma ir inkstų ląstelių karcinoma [147]. Be to, klinikiniai tyrimai, kuriuose naudojamas anti-PD-1 antikūnas nivolumabas, rodo viltį teikiančius rezultatus pacientams, sergantiems ir kitomis išplitusio vėžio formomis [148]. Šiuo metu Nivolumabas testuojamas III fazės tyrimuose.

Panašiai kaip CTLA-4 ir PD-1, imunines reakcijas moduliuojančių molekulių taikinių grupei priklauso dar viena potenciali molekulė – Tim-3. Nors klinikinių tyrimų duomenų dar nėra, tačiau jau pastebėta Tim-3 raiška kartu su PD-1 naviko antigenui specifinių CD8+ T limfocitų paviršiuje. Blokuojant abi šias molekules reikšmingai padidėja T limfocitų proliferacija bei citokinų sekrecija in vitro [149, 150, 151]. Tyrimai in vivo parodė, kad užblokavus tik Tim-3 molekulę arba kartu su PD-1 stabdomas melanomos augimas [151, 152]. Be to, šie duomenys parodė, kad naviką infiltruojančios DLs įgimto imuninio atsako reakcijas slopina per TIM-3 receptoriaus ir aliarmino HMGB1 sąveiką [153]. Tokiu būdu buvo nustatytas naujas NMA priešnavikinio imuniteto slopinimo mechanizmas. Straipsnio autorės nustatė, kad TIM-3 blokada atkuria melanoma sergančių pacientų NK ląstelių funkcijas ir stimuliuoja priešnavikinio imuniteto reakcijas [154].

Taigi iš pateiktų rezultatų matome, kad DLs turi galimybę sukelti specifinį priešnavikinį imuninį atsaką, tačiau kai kurie NMA komponentai gali keisti jų fenotipą ir funkcijas iš imunokompetentinių į imunosupresines DLs. NMA ne tik silpnina specifinį T ląstelių atsaką, bet ir suaktyvina imuninę sistemą slopinančias DLs funkcijas. Norint pasiekti ilgalaikį navikui specifinį imunitetą ir surasti veiksmingus priešvėžinės imunoterapijos metodus, reikia ne tik stiprinti DLs funkcijas jas stimuliuojant ex vivo, tačiau ir taikininės terapijos metodais perprogramuoti imuninę sistemą slopinančią naviko mikroaplinką.

Pabaigai

Dėl savo unikalių savybių DLs idealiai tinka vakcinacijai. Šios ląstelės apjungia įgimtą ir įgytą imuninius atsakus, jų sąveiką su T ir B ląstelėmis, kontroliuoja imuninės sistemos kovą su patogenais. Imuninį atsaką taip pat lemia DL sąveika su antigenu ir (arba) adjuvantu (pagalbine medžiaga). Tačiau kuriant priešvėžines DL vakcinas dėmesį reikėtų atkreipti į imuninių mechanizmų sudėtingumą. Šioje srityje svarbų vaidmenį vaidina gyvūnų modeliai, tačiau gautus tokių tyrimų rezultatus reikėtų kruopščiai interpretuoti ir pritaikyti žmonėms. Kuriant gerus eksperimentinius modelius neužtenka fakto, kad bet kuri rūšis pasižymi panašiomis efektorinėmis imuninės sistemos funkcijomis. Be to, taip pat svarbu atsižvelgti į tai, kad pelės ir žmonės turi skirtingą imlumą (jautrumą) kai kurioms ligoms (pavyzdžiui, pelės neserga ŽIV). 

Yra daug veiksnių, darančių įtaką DL sąveikai su imunine sistema ir sukeliančių veiksmingą imuninį atsaką. Naudojant skirtingus DLs stimuliacijos metodus, pasiekiama skirtinga imuninės sistemos sužadinimo būsena. 

Taigi detalesnis supratimas apie DL ir imuninės sistemos tarpusavio ryšius, pasitarnaus kuriant vakcinas prieš maliariją, ŽIV, tuberkuliozę, gydant onkologines ligas, alergijas ir autoimunines ligas ar transplantato atmetimą po organų persodinimo.

Literatūra

[1] Steinman RM, Cohn ZA. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 1973 May 1; 137(5):1142-62. 
[2] Kumar S., Jack, R. Origin of monocytes and their differentiation to macrophages and dendritic cells. Journal of Endotoxin Research 2006, 5(12), p. 278–284. 
[3] Conti L, Gessani S. GM-CSF in the generation of dendritic cells from human blood monocyte precursors: Recent advances. Immunobiology 2008, 213, p. 859–870. 
[4] Shortman K., Liu YJ. Mouse and human dendritic cell subtypes. Nat Rev Immunol 2002, 2:151.
[5] Collin M, McGovern N, Haniffa M. Human dendritic cell subsets. Immunology 2013, Sep; 140(1):22-30.
[6] Dhodapkar MV., et al. Antigen-specific inhibition of effector T cell function in humans after injection of immature dendritic cells. J Exp Med 2001, Jan 15; 193(2):233-8.
[7] Doherty GJ, McMahon HT. Mechanisms of endocytosis. Annu Rev Biochem 2009; 78:857-902.
[8] Aragoneses-Fenoll, L. and A. L. Corbi. Dendritic cells: still a promising tool for cancer immunotherapy. Clinical and Translational Oncology 2007, 9(2):77-82.
[9] Villadangos, J. A. and L. Young. Antigen-presentation properties of plasmacytoid dendritic cells. Immunity 2008, 29(3):352-361.
[10] El Shikh ME., et al. Activation of B cells by antigens on follicular dendritic cells. Trends Immunol 2010, Jun; 31(6):205-11.
[11] Trombetta, E. S. and I. Mellman. Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo. Annual Review of Immunology 2005, 23:975-1028.
[12] Redmond WL., et al. Distinct requirements for deletion versus anergy during CD8 T cell peripheral tolerance in vivo. J Immunol 2005 Feb 15; 174(4):2046-53.
[13] Prazma CM and Tedder TF. Dendritic cell CD83: A therapeutic target or innocent bystander? Immunology Letters 2008, 115(1):1-8.
[14] Satthaporn S. and Eremin O. Dendritic cells (I): biological functions. J R Coll Surg Edinb 2001, 46(1): 9-19.
[15] Benvenuti F., Lagaudriere-Gesbert C., et al. Dendritic cell maturation controls adhesion, synapse formation, and the duration of the interactions with naive T lymphocytes. Journal of Immunology 2004, 172(1):292-301.
[16] Ju X., Clark G., et al. Review of human DC subtypes. Methods Mol Biol 2010, 595:3-20.
[17] Martín-Fontecha A., et al. Dendritic cell migration to peripheral lymph nodes. Handb Exp Pharmacol 2009, (188):31-49. 
[18] Trombetta ES, Mellman I. Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo. Annu Rev Immunol 2005; 23:975-1028. 
[19] Rescigno M. et al. Coordinated events during bacteria-induced DC maturation. Immunol Today 1999 May; 20(5):200-3.
[20] Akbari O. et al. DNA vaccination: transfection and activation of dendritic cells as key events for immunity. J Exp Med 1999 Jan 4; 189(1):169-78.
[21] Caux C., et al. CD34+ hematopoietic progenitors from human cord blood differentiate along two independent dendritic cell pathways in response to granulocyte-macrophage colony-stimulating factor plus tumor necrosis factor alpha: II. Functional analysis. Blood 1997 Aug 15; 90(4):1458-70.
[22] Winzler C., et al. Maturation stages of mouse dendritic cells in growth factor-dependent long-term cultures. J Exp Med 1997 Jan 20; 185(2):317-28.
[23] Wakkach A., et al Characterization of dendritic cells that induce tolerance and T regulatory 1 cell differentiation in vivo. Immunity 2003 May; 18(5):605-17.
[24] Steinman RM, et al. The induction of tolerance by dendritic cells that have captured apoptotic cells. J Exp Med 2000 Feb 7; 191(3):411-6.
[25] Brière F., et al. Origin and filiation of human plasmacytoid dendritic cells. Hum Immunol 2002 Dec; 63(12):1081-93.
[26] Bendriss-Vermare N., et al. Human thymus contains IFN-alpha-producing CD11c(-), myeloid CD11c(+), and mature interdigitating dendritic cells. J Clin Invest 2001 Apr; 107(7):835-44.
[27] Steinman RM., et al. Tolerogenic dendritic cells. Annu Rev Immunol 2003; 21:685-711. Epub 2001 Dec 19.
[28] Jonuleit H., et al. Dendritic cells as a tool to induce anergic and regulatory T cells. Trends Immunol 2001 Jul; 22(7):394-400.
[29] Wilson NS., et al. Dendritic cells constitutively present self antigens in their immature state in vivo and regulate antigen presentation by controlling the rates of MHC class II synthesis and endocytosis. Blood 2004 Mar 15; 103(6):2187-95. Epub 2003 Nov 6.
[30] Steinbrink K., et al. Induction of tolerance by IL-10-treated dendritic cells. J Immunol 1997 Nov 15; 159(10):4772-80.
[31] Lutz MB, Schuler G. Immature, semi-mature and fully mature dendritic cells: which signals induce tolerance or immunity? Trends Immunol 2002 Sep; 23(9):445-9.
[32] Schulz O., et al. CD40 triggering of heterodimeric IL-12 p70 production by dendritic cells in vivo requires a microbial priming signal. Immunity 2000 Oct; 13(4):453-62.
[33] Vieira PL., et al. Development of Th1-inducing capacity in myeloid dendritic cells requires environmental instruction. J Immunol 2000 May 1; 164(9):4507-12.
[34] Kalinski P., et al. Dendritic cells, obtained from peripheral blood precursors in the presence of PGE2, promote Th2 responses. Adv Exp Med Biol 1997, 417, 363–367.
[35] Kalinski P., et al. Prostaglandin E(2) is a selective inducer of interleukin-12 p40 (IL-12p40) production and an inhibitor of bioactive IL-12p70 heterodimer. Blood 2001, 97, 3466–3469.
[36] Nguyen H. Q., et al. Calcium signaling inhibits interleukin-12 production and activates CD83(+) dendritic cells that induce Th2 cell development. Blood 2001, 98, 2489–2497.
[37] Jonuleit H., et al. Dendritic cells as a tool to induce anergic and regulatory T cells. Trends Immunol 2001, 22, 394–400.
[38] Grabbe S., et al. Tumor antigen presentation by murine epidermal cells. J Immunol 1991, 146, 3656–3661.
[39] Flamand V., et al. Murine dendritic cells pulsed in vitro with tumor antigen induce tumor resistance in vivo. Eur J Immunol 1994, 24, 605–610.
[40] Zitvogel L., et al. Eradication of established murine tumors using a novel cell-free vaccine: dendritic cell-derived exosomes. Nat Med 1998, 4, 594–600.
[41] Banchereau J., Palucka, A. K. Dendritic cells as therapeutic vaccines against cancer. Nat Rev Immunol 2005, 5, 296–306.
[42] Su Z., et al. Immunological and clinical responses in metastatic renal cancer patients vaccinated with tumor RNA-transfected dendritic cells. Cancer Res 2003, 63, 2127–2133.
[43] Nair, S. K., et al. Induction of tumor-specific cytotoxic T lymphocytes in cancer patients by autologous tumor RNA-transfected dendritic cells. Ann Surg 2002, 235, 540–549.
[44] Rosenberg S. A., Dudley M. E. Cancer regression in patients with metastatic melanoma after the transfer of autologous antitumor lymphocytes. Proc Natl Acad Sci USA 2004, 101, Suppl 2, 14639–14645.
[45] Maker A. V., et al. Tumor regression and autoimmunity in patients treated with cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 blockade and interleukin 2: a phase I/II study. Ann Surg Oncol 2005, 12, 1005–1016.
[46] Larsson, M., et al. Efficiency of cross presentation of vaccinia virus-derived antigens by human dendritic cells. Eur J Immunol 2001, 31, 3432–3442.
[47] Somersan, S., et al. Primary tumor tissue lysates are enriched in heat shock proteins and induce the maturation of human dendritic cells. J Immunol 2001, 167, 4844–4852.
[48] Smits, E. L., et al. Proinflammatory response of human leukemic cells to dsRNA transfection linked to activation of dendritic cells. Leukemia 2007, 21, 1691–1699.
[49] Vieira, P. L., et al. Development of Th1-inducing capacity in myeloid dendritic cells requires environmental instruction. J Immunol 2000, 164, 4507–4512.
[50] Van Duin D., et al. Triggering TLR signaling in vaccination. Trends Immunol 2006, 27, 49–55.
[51] Zobywalski A., et al. Generation of clinical grade dendritic cells with capacity to produce biologically active IL-12p70 (Online). J Transl Med 2007, 5, 18.
[52] Cools, N., et al. Immunosuppression induced by immature dendritic cells is mediated by TGF-beta/IL-10 double-positive CD4+ regulatory T cells. J Cell Mol Med 2008 Apr; 12(2):690-700.
[53] Tarbell KV, et al. CD25+CD4+ T cells, expanded with dendritic cells presenting a single autoantigenic peptide, suppress autoimmune diabetes. J Exp Med 2004 Jun ; 199(11):1467-77.
[54] Salomon B., et al. B7/CD28 costimulation is essential for the homeostasis of the CD4+CD25+ immunoregulatory T cells that control autoimmune diabetes. Immunity 2000, 12: 431-440.
[55] Wu Q., et al. Reversal of spontaneous autoimmune insulitis in nonobese diabetic mice by soluble lymphotoxin receptor. J Exp Med 2001,193:1327-1332.
[56] Keul R, et al. A possible role for soluble IL-6 receptor in the pathogenesis of systemic onset juvenile chronic arthritis. Cytokine 1998, 10:729-34. 
[57] Mannon PJ, et al. Anti-interleukin-12 antibody for active Crohns disease. N Engl J Med 2004, 351:2069-79.
[58] Cargill M, et al. A large-scale genetic association study confirms IL-12B and leads to the identification of IL-23 R as psoriasis-risk genes. Am J Hum Genet 2007, 80:273-90. 
[59] Duerr RH, et al. A genome-wide association study identifies IL23R as an inflammatory bowel disease gene. Science 2006, 314:1461-3. 
[60] Feldmann M, Maini RN. Anti-TNF alpha therapy of rheumatoid arthritis: what have we learned? Annu Rev Immunol 2001, 19:163-96. 
[61] Victor FC, Gottlieb AB, Menter A. Changing paradigms in dermatology: tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha) blockade in psoriasis and psoriatic arthritis. Clin Dermatol 2003, 21:392-7. 
[62] Banchereau J, Pascual V, Palucka AK. Autoimmunity through cytokine-induced dendritic cell activation. Immunity 2004, 20:539-50. 
[63] Banchereau J, Pascual V. Type I interferon in systemic lupus erythematosus and other autoimmune diseases. Immunity 2006, 25:383-92.
[64] Figdor CG., et al. Dendritic cell immunotherapy: mapping the way. Nat Med 2004 May; 10(5):475-80.
[65] Pinzon-Charry A., et al. Numerical and functional defects of blood dendritic cells in early- and late-stage breast cancer. Br J Cancer 2007 Nov 5; 97(9):1251-9. Epub 2007 Oct 9. 
[66] Pulendran B., et al. Flt3-ligand and granulocyte colony-stimulating factor mobilize distinct human dendritic cell subsets in vivo. J Immunol 2000, 165:566.
[67] Romani N., et al. Proliferating dendritic cell progenitors in human blood. J Exp Med 1994, 180:83.
[68] Sallusto F., Lanzavecchia A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med 1994, 179:1109.
[69] Berger TG., et al. Efficient elutriation of monocytes within a closed system (Elutra (TM)) for clinical-scale generation of dendritic cells. J Immunol Methods 2005, 298(1-2):61-72.
[70] Dohnal AM., et al. CD40 ligation restores type 1 polarizing capacity in TLR4-activated dendritic cells that have ceased interleukin-12 expression. J Cell Mol Med 2009, 13(8B): 1741-1750.
[71] López JA., et al. Single step enrichment of blood dendritic cells by positive immunoselection. J Immunol Methods 2003, 274(1–2):47-61.
[72] Tseng SY., et al. Generation of immunogenic dendritic cells from human embryonic stem cells without serum and feeder cells. Regen Med 2009, 4(4):513-526.
[73] Campbell JD., et al.  Isolation and generation of clinical-grade dendritic cells using the CliniMACS System. Methods Mol Med 2005, 109:55-70.
[74] Osugi Y., et al. Myeloid blood CD11c(+) dendritic cells and monocyte-derived dendritic cells differ in their ability to stimulate T lymphocytes. Blood 2002, 100(8):2858-2866.
[75] Orsini E., Foa R. Dendritic cell generation for leukemia immunotherapy. Leuk Res 2002, 26(4):409-410.
[76] Brown RD., et al. Dendritic cells from patients with myeloma are numerically normal but functionally defective as they fail to up-regulate CD80 (B7-1) expression after huCD40LT stimulation because of inhibition by transforming growth factor-beta(1) and interleukin-10. Blood 2001, 98(10):2992-2998.
[77] Kalinski P., et al. T-cell priming by type-1 and type-2 polarized dendritic cells: the concept of a third signal. Immunol Today 1999, 20(12):561-567.
[78] Kalinski P, et al. Dendritic cell-based therapeutic cancer vaccines: what we have and what we need. Future Oncol 2009; 5:379-390.
[79] Schijns V., et al. Immune adjuvants as critical guides directing immunity triggered by therapeutic cancer vaccines. Cytotherapy 2014 Apr; 16(4):427-39. 
[80] Appay V, et al. CD8+ T cell efficacy in vaccination and disease. Nat Med Jun 2008, 14(6):623-628.
[81] Harlin H., et al. Chemokine expression in melanoma metastases associated with CD8+ T-cell recruitment. Cancer Res 2009, 69:3077-3085.
[82] Palucka K, Banchereau J. Cancer immunotherapy via dendritic cells. Nat Rev Cancer 2012, 12:265-277.
[83] Schuster SJ, et al. Idiotype vaccine therapy (BiovaxID) in follicular lymphoma in first complete remission: Phase III clinical trial results. ASCO Meeting Abstracts 2009, 27:2.
[84] Nguyen-Pham TN, et al. Cellular immunotherapy using dendritic cells against multiple myeloma. Korean J Hematol 2012, 47:17-27.
[85] Arico E, et al. Immature monocyte derived dendritic cells gene expression profile in response to Virus-Like Particles stimulation. J Transl Med 2005, 3:45.
[86] Pereira SR, et al. Changes in the proteomic profile during differentiation and maturation of human monocyte-derived dendritic cells stimulated with granulocyte macrophage colony stimulating factor/interleukin-4 and lipopolysaccharide. Proteomics 2005, 5:1186–1198.
[87] Hashimoto SI, et al. Identification of genes specifically expressed in human activated and mature dendritic cells through serial analysis of gene expression. Blood 2000, 96:2206–2214.
[88] Duenas AI, et al. Francisella tularensis LPS induces the production of cytokines in human monocytes and signals via Toll-like receptor 4 with much lower potency than E. coli LPS. Int Immunol 2006, 18:785–795.
[89] Yoshikawa H, et al. Nicotine inhibits the production of proinflammatory mediators in human monocytes by suppression of I-kappaB phosphorylation and nuclear factor- kappaB transcriptional activity through nicotinic acetylcholine receptor alpha7. Clin Exp Immunol 2006, 146:116–123.
[90] Vulcano M, et al. Toll receptor-mediated regulation of NADPH oxidase in human dendritic cells. J Immunol 2004, 173:5749–5756.
[91] Pivarcsi A, et al. CC chemokine ligand 18, an atopic dermatitisassociated and dendritic cell-derived chemokine, is regulated by staphylococcal products and allergen exposure. J Immunol 2004, 173:5810–5817.
[92] Appay V, Rowland-Jones SL. RANTES: a versatile and controversial chemokine. Trends Immunol 2001, 22:83-87.
[93] Schutyser E, et al. The CC chemokine CCL20 and its receptor CCR6. Cytokine Growth Factor Rev 2003, 14:409-426.
[94] Schutyser E, et al. Involvement of CC chemokine ligand 18 (CCL18) in normal and pathological processes. J Leukoc Biol 2005, 78:14-26.
[95] Mandal M, et al. The BCL2A1 gene as a pre-T cell receptorinduced regulator of thymocyte survival. J Exp Med 2005, 201:603-614.
[96] Perera PY, et al. Lipopolysaccharide and its analog antagonists display differential serum factor dependencies for induction of cytokine genes in murine macrophages. Infect Immun 1998, 66:2562-2569.
[97] Messmer D, et al. The global transcriptional maturation program and stimulispecific gene expression profiles of human myeloid dendritic cells. Int Immunol 2003, 15:491–503.
[98] Korthals M, et al. Monocyte derived dendritic cells generated by IFNalpha acquire mature dendritic and natural killer cell properties as shown by gene expression analysis. J Transl Med 2007, 5:46.
[99] Matsunaga T, et al. Analysis of gene expression during maturation of immature dendritic cells derived from peripheral blood monocytes. Scand J Immunol 2002, 56:593–601.
[100] Tureci O, et al. Cascades of transcriptional induction during dendritic cell maturation revealed by genome-wide expression analysis. FASEB J 2003, 17:836–847. 
[101] Wang YC, et al. Lipopolysaccharide-induced maturation of bone marrow-derived dendritic cells is regulated by Notch Signaling through the up-regulation of CXC R4. J Biol Chem 2009, 284:15993-16003.
[102] Satyam A, et al. Involvement of T(H)1/T(H)2 cytokines in the pathogenesis of autoimmune skin disease-pemphigus vulgaris. Immunological Investigations 2009, 38:498–509.
[103] Decker WK, et al. Deficient T(H)-1 responses from TNF-alpha-matured and alpha-
[104] CD40-matured dendritic cells. J Immunother 2008, 31:157-165.
[105] Severa M, et al. Differential responsiveness to IFN-alpha and IFN-beta of human mature DC through modulation of IFNAR expression. J Leukoc Biol 2006, 79:1286–1294.
[106] Blanco P, et al. Dendritic cells and cytokines in human inflammatory and autoimmune diseases. Cytokine Growth Factor Rev 2008; 19:41–52.
[107] Korthals M, et al. Monocyte derived dendritic cells generated by IFNalpha acquire mature dendritic and natural killer cell properties as shown by gene expression analysis. J Transl Med 2007, 5:46.
[108] Santini SM, et al. IFN-alpha in the generation of dendritic cells for cancer immunotherapy. Handb Exp Pharmacol 2009, 295–317.
[109] Moller I, et al. Dendritic cell maturation with poly(I:C)-based versus PGE2-based cytokine combinations results in differential functional characteristics relevant to clinical application. J Immunother 2008, 31:506–519.
[110] Spisek R, et al. Standardized generation of fully mature p70 IL-12 secreting monocyte-derived dendritic cells for clinical use. Cancer Immunol Immunother 2001, 50:417–427.
[111] Colic M, et al. Comparison of two different protocols for the induction of maturation of human dendritic cells in vitro. Vojnosanit Pregl 2004, 61:471–478.
[112] Muthuswamy R, et al. Ability of mature dendritic cells to interact with regulatory T cells is imprinted during maturation. Cancer Res 2008, 68:5972–5978.
[113] Lee AW, et al. A clinical grade cocktail of cytokines and PGE2 results in uniform maturation of human monocyte-derived dendritic cells: implications for immunotherapy. Vaccine 20 Suppl. 2002, 4:A8–A22.
[114] Liu W, Kelly KA. Prostaglandin E-2 modulates dendritic cell function during chlamydial genital infection. Immunology 2008, 123:290–303.
[115] Kyte JA, et al. Phase I/II trial of melanoma therapy with dendritic cells transfected with autologous tumor-mRNA. Cancer Gene Ther 2006, 13:905–918. 
[116] Kyte JA, et al. Unconventional cytokine profiles and development of T cell memory in long-term survivors after cancer vaccination. Cancer Immunology Immunotherapy 2009, 58:1609–1626.
[117] Soleimani A, et al. Immune responses in patients with metastatic renal cell carcinoma treated with dendritic cells pulsed with tumor lysate. Scandinavian Journal of Immunology 2009, 70:481–489.
[118] Jin P, et al. Molecular signatures of maturing dendritic cells: implications for testing the quality of dendritic cell therapies. J Transl Med 2010, 8:4.
[119] Felzmann T, et al. Semi-mature IL-12 secreting dendritic cells present exogenous antigen to trigger cytolytic immune responses. Cancer Immunol Immunother 2005, 54:769–780.
[120] Massague J.TGF beta in cancer. Cell 2008, 134:215–30.
[121] Chomarat P, et al. IL-6 switches the differentiation of monocytes from dendritic cells to macrophages. Nat Immunol 2000, 1:510–4.
[122] Steinbrink K, et al. Interleukin-10-treated human dendritic cells induce a melanoma-antigen-specific anergy in CD8(+) T cells resulting in a failure to lyse tumor cells. Blood 1999, 93:1634–42.
[123] KawakamiY, et al. Improvement of cancer immunotherapy by combining molecular targeted therapy. Front Oncol 2013, 3:136.
[124] Qian BZ, et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature 2011, 475:222–5.
[125] Gabrilovich D, et al. Vascular endothelial growth factor inhibits the development of dendritic cells and dramatically affects the differentiation of multiple hematopoietic lineages in vivo. Blood 1998, 92:4150–66.
[126] Tai X, et al. Basis of CTLA-4 function in regulatory and conventional CD4 (+) T cells. Blood 2012, 119:5155–63.
[127] Oderup C, et al. Cytotoxic T lymphocyte antigen-4-dependent down-modulation of costimulatory molecules on dendritic cells in CD4+ CD25+ regulatory T-cell-mediated suppression. Immunology 2006, 118:240–9.
[128] Bronte V, et al. Apoptotic death of CD8+ T lymphocytes after immunization: induction of a suppressive population of Mac-1+/Gr-1+cells. J Immunol 1998, 161:5313–20.
[129] Seung LP, et al. Synergy between T-cell immunity and inhibition of paracrine stimulation causes tumor rejection. Proc Natl Acad Sci USA 1995, 92:6254–8.
[130] Huang B, et al.Gr-1+ CD115+ immature myeloid suppressor cells mediate the development of tumor-induced T regulatory cells and T-cell anergy in tumor-bearing host. CancerRes 2006, 66:1123–31.
[131] Gabrilovich DI, Nagaraj S. Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system. Nat Rev Immunol 2009, 9:162–74.
[132] Bronte V. Myeloid-derived suppressor cells in inflammation: uncovering cell subsets with enhanced immunosuppressive functions. Eur J Immunol 2009, 39:2670–2.
[133] Highfill SL, et al. Bone marrow myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) inhibit graft-versus- host disease (GVHD) via an arginase-1-dependent mechanism that is up- regulated by interleukin-13. Blood 2010, 116:5738–47.
[134] Mantovani A, Sica A. Macrophages, innate immunity and cancer: balance, tolerance, and diversity. Curr Opin Immunol 2010, 22:231–7.
[135] Qian BZ, Pollard JW. Macrophage diversity enhances tumor progression and metastasis. Cell 2010, 141:39–51.
[136] Sica A, Bronte V. Altered macrophage differentiation and immune dysfunction in tumor development. J Clin Invest 2007, 117:1155–66.
[137] Oppenheim JJ, et al. Alarmins initiate host defense. Adv Exp Med Biol 2007, 601:185–94.
[138] Egeblad M, Werb Z. New functions for the matrix metalloproteinases in cancer progression. Nat Rev Cancer 2002, 2:161–74.
[139] Kessenbrock K, et al. Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment. Cell 2010, 141:52–67.
[140] ItoT, et al. TSLP-activated dendritic cells induce an inflammatory T helper type 2 cell response through OX40 ligand. J Exp Med 2005, 202:1213–23.
[141] Aspord C, et al. Breast cancer instructs dendritic cells to prime interleukin 13-secreting CD4+  T cells that facilitate tumor development. J Exp Med 2007, 204:1037–47.
[142] De Monte L, et al. Intratumor T helper type 2 cell infiltrate correlates with cancer-associated fibroblast thymic stromal lymphopoietin production and reduced survivalin pancreatic cancer. J ExpMed 2011, 208:469–78.
[143] Yang D, et al. Eosinophil- derived neurotoxin acts as an alarmin to activate the TLR2-MyD88 signal path- way in dendritic cells and enhances Th 2 immune responses. J ExpMed 2008, 205:79–90.
[144] Willingham SB, et al. The CD47-signal regulatory protein alpha (SIRPa) interaction is a therapeutic target for human solid tumors. Proc Nat lAcad Sci USA 2012, 109:6662–7.
[145] Hawiger D, et al. Dendritic cells induce peripheral T cell unresponsiveness under steady state conditions in vivo. J ExpMed 2001, 194:769–79.
[146] Yuan J, et al. CTLA-4 blockade enhances polyfunctional NY-ESO-1specific T cell responses in metastatic melanoma patients with clinical benefit. Proc Natl Acad Sci USA 2008, 105:20410–5.
[147] Hodi FS, et al. Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma. N Engl J Med 2010, 363:711–23.
[148] Brahmer JR, et al. Safety and activity of anti-PD-L1 antibody in patients with advanced cancer. N Engl J Med 2012, 366:2455–65.
[149] Topalian SL, et al. Safety, activity, and immune correlates of anti-PD-1 antibody in cancer. N Engl J Med 2012, 366:2443–54.
[150] Baitsch L, et al. Extended co-expression of inhibitory receptors by human CD8 T-cells depending on differentiation, antigen-specificity and anatomic allocalization. PLoSOne 2012, 7:e30852.
[151] Fourcade J, et al. Upregulation of Tim-3 and PD-1expression is associated with tumor antigen- specific CD8+ T cell dysfunction in melanoma patients. J ExpMed 2010, 207:2175–86.
[152] Sakuishi K, et al. Targeting Tim-3 and PD-1 pathways to reverse T cell exhaustion and restore anti- tumor immunity. J ExpMed 2010, 207:2187–94.
[153] Ngiow SF, et al. Anti-TIM3 antibody promotes T cell IFN-gamma-mediated antitumor immunity and suppresses established tumors. CancerRes 2011, 71:3540–51.
[154] Chiba S, et al.Tumor-infiltrating DC suppress nucleic acid-mediated innate immune responses through interactions between the receptor TIM-3 and the alarmin HMGB1. Nat Immunol 2012, 13:832–42.
[155] Gallois A, Bhardwaj N. Dendritic cell-targeted approaches to modulate immune dysfunction in the tumor microenvironment. Front Immunol 2013 Dec 10; 4:436.

Lecturer