Biofarmacija. Naujovės

Free Register

Pastaruoju metu Europos Sąjunga skatina ir remia naujoviškų vaistų iniciatyvas tam, kad būtų paspartintas naujų vaistų nuo tokių ligų, kaip vėžys, uždegiminės ir infekcinės ligos, paieškos ir kūrimas. Šiuo metu taikomų biotechnologijų produktai daugiausia naudojami diagnostikai (monokloniniai antikūnai), terapijai (kamieninės ląstelės) ir prevencijai ( vakcinos). 

Antikūnai

Antikūnai yra plačiai taikomi eksperimentinėje biologijoje, medicinoje, biomedicininiuose moksliniuose tyrinėjimuose, diagnostikoje ir terapiniais tikslais. Hibridomų technologijos sukūrimas atvėrė galimybes sintetinti labai specifiškus monokloninius antikūnus, kurie plačiai taikomi praktikoje. Pastaraisiais dešimtmečiais, tobulėjant molekulinės biologijos metodams, sukurti rekombinantinių antikūnų konstravimo būdai, leidžiantys gaminti antikūnus in vitro, nenaudojant laboratorinių gyvūnų, o panaudojant bakterijas, augalų ir gyvūnų ląstelių kultūras.

Monokloniniai antikūnai

Imuninė sistema sugeba atsakyti į labai didelį kiekį įvairių antigenų. Antigeno (imunogeno) epitopai aktyvuoja ląstelių klonus, produkuojančius antikūnus su skirtingu specifiškumu ir afiniškumu. Pagal imuniteto klonų – selekcijos teoriją, viena plazminė ląstelė sintezuoja ir sekretuoja vieno specifiškumo antikūnus. Antikūnai, gauti imunizacijos būdu yra polispecifiniai ir reguoja su skirtingomis antigeno determinantėmis. Šiuos antikūnus produkuoja skirtingi ląstelių klonai. Norint gauti antikūnus prieš vieną antigeninę determinantę yra taikomas ląstelių hibridizacijos metodas, kurį 1975 m sukūrė Kioleris ir Milšteinas. Vykdant dviejų somatinių ląstelių hibridizaciją, gaunamas hibridas (hibridoma), produkuojantis monokloninius antikūnus. Kiekviena hibridinė ląstelė turi genus, paveldėtus iš mielominių ląstelių ir blužnies imuninio B-limfocito, todėl jų produkuojami imunoglobulinai (antikūnai) yra homogeniški ir atpažįsta tik vieną antigeninę determinantę ir turi apibrėžtą afiniškumo konstantą. Monokloniniai antikūnai yra produkuojami ląstelių klono, kilusio iš vienos hibridomos. Hibridominės technologijos dėka galima gauti neribotą kiekį pasirinkto specifiškumo homogeninių antikūnų, vadinamų monokloniniais antikūnais. Unikali monokloninių antikūnų savybė yra ta, kad jie sugeba atpažinti vieną epitopą sudėtingoje antigeninėje struktūroje.

Monokloninių antikūnų gavimas

Pagrindiniai monokloninių antikūnų gavimo etapai: mielominių ląstelių parinkimas ir kultivavimas; imuninės blužnies limfocitų gavimas (pelių BALB/c imunizacija); ląstelių hibridizacija, selekcija, klonavimas; specifiškumo įvertinimas, antikūnų izotipavimas; gryninimas ir kriokonservavimas. Pastaruoju metu hibridomų gavimui naudojamos įvairios skirtingų gyvūnų rūšių mielominės ląstelių linijos, dažniausiai naudojamos plazmocitominės pelių linijos, kurios gaunamos įskiepijant pelėms MOPC-21. Imunizacijos tikslas – B-limfocitų klono, produkuojančio antikūnus prieš pasirinktą antigeną, indukcija Ląstelių suliejimui gali būti naudojami Epšteino-Baro arba Sendai virusai, elektrošokas, polietilenglikolis (PEG). Hibridizacijos mechanizmas nėra pilnai aiškus, minėtų medžiagų poveikyje vyksta ląstelių sulipimas ir membranų susiliejimas. Po suliejimo susidaro kelių rūšių hibridai: mieloma-blužnies limfocitas, mieloma-mieloma, blužnies limfocitas-blužnies limfocitas. Todėl svarbi hibridinių ląstelių atranka, panaudojant selektyvias terpes. Tam, kad gautume vieno klono ląstelių suspensiją, atliekamas hibridomų klonavimas ir reklonavimas limituojančių atskiedimų metodu. Po to vykdoma antikūnų produkcijos kontrolė. Paruošiamas hibridomos pasas, kuriame nurodyta suliejimui naudojamos tėvinės ląstelės, selekcijos sistema, klonavimas, reklonavimas, hibridomos stabilumas in vitro ir in vivo, antikūnų izotipas, antikūnų produkcija bei titras augimo terpėje bei ascite, krioprotektorius.

Monokloninių antikūnų panaudojimas.

Specifiniai monokloniniai antikūnai taikomi ląstelių biologijos eksperimentiniuose tyrimuose: viduląstelinių ir ekstraląstelinių baltymų identifikavimui, jų lokalizacijos ir ekspresijos lygio ivertinimui. Monokloniniai antikūnai svarbūs ląstelių rūšiavimui į populiacijas ir subpopuliacijas pagal jų paviršiaus žymenų ekspresiją. Monokloninių antikūnų pagrindu sukurti jautrūs imunodiagnostikos metodai: radioimunininis, imunofermentinis, imunofluorescencija, tėkmes citometrija, imunoelektroforezė, imunoafininė chromatografija, imunoblotingas ir kt. Monokloniniai antikūnai sėkmingai naudojami kuriant įvairius imunosensorius.

Diagnostikos tikslais dažniausiai naudojami monokloniniai antikūnai prieš vėžio žymenis: prostatos specifinį antigeną; kiaušidžių bei krūtų vėžio žymenį; kasos vėžio ir virškinamojo trakto žymenį; kepenų karcinomos ir sėklidžių vėžio žymenį alfafetoproteiną; lytinių ląstelių navikų ir trofoblastinių ligų žymenį – chorioninį gonadotropiną; diferencijuoto skydliaukės vėžio žymenį – tiroglobuliną. Specifiniai monokloniniai antikūnai naudojami ne tik vėžio, bet ir kitų ligų diagnostikai, pvz., Laimo ligos, autoimuninių ir virusiniu ligų.

Monokloniniai antikūnai taip pat naudojami imunoterapijoje. Jie gali veikti kaip imuninės sistemos supresoriai, pvz., muromonab, kuris sąveikauja su CD3molekule T-ląstelių paviršiuje; infliximab – monokloniniai antikūnai, specifiški auglių nekrozės faktoriui, naudojami esant autoimuniniams susirgimams. Rituximab suriša CD20 molekules B- ląstelių paviršiuje ir taikomi limfomos gydymui, trastuzumab vartojamas esant krūties vėžiui, cetuximab naudojama gydant kolorektalinį vėžį. Specifinis antikūnas gali jungtis prie storosios žarnos piktybinių navikų ląstelėse gausiai esančio epidermio augimo faktoriaus receptoriaus ir, jį blokuodamas, stabdo šių ląstelių dalijimąsi. Alemtuzumab jungiasi prie leukocituose esančio CD52 antigeno ir sukelia remisijas lėtinės limfocitinės leukemijos atveju.

Lietuvoje Biotechnologijos institute sukurti antikūnai prieš •žmogaus IgG, IgA, IgM, citokinus ir hormonus: IL-3, G-CSF, IFN-a, IFN-g, TNF-a, MIF, angiogeniną, antitripsiną, insuliną; rekombinantinius receptorius: PACAP, Vr, OCT; virusų baltymus: tymų, kiaulytės, poliomos virusų, hantavirusų nukleokapsidės baltymus; vėžinius epitopus: Muc1, WT1. VU Imunologijos institute ( dabar VMTI Inovatyvios Medicinos Centras) sukurti antikūnai prieš galvijų leukozės viruso p24 ir gp51 antigenus, kurių pagrindu   buvo sukurti diagnostiniai rinkiniai šių susirgimų nustatymui ankstyvose ligos stadijose.

Bispecifiniai monokloniniai antikūnai

Žinoma, kad monokloninių antikūnų imunoglobulino G (IgG) molekulė turi dvi antigeno surišimo vietas tam pačiam antigenui. Bispecifiniai IgG gali surišti du skirtingo specifiškumo antigenus. Ši savybė leidžia šiuos antikūnus panaudoti auglių lokalizacijos nustatymui bei vėžinių ląstelių sunaikinimui.

Išskiriami du bispecifinių antikūnų gavimo būdai: biologinis ir cheminis

Biologinis bispecifinių antikūnų gavimo būdas (heterohibridomos)

Heterohibridoma (kvadroma) yra dviejų hibridomų hibridas. Kvadroma buvo sukurta 1980 m. (JAV patentas 4. 474. 893). Kvadromos produkuoja bispecifinius monokloninius antikūnus. Atliekama dviejų hibridinių ląstelių, produkuojančių monokloninius antikūnus prieš skirtingus antigenus, suliejimą ir gaunamas hibridomų hibridas – kvadroma. Gauta kvadroma produkuoja monokloninius antikūnus, galinčius surišti du skirtingo specifiškumo antigenus. Principinė kvadromų gavimo schema yra tokia pat kaip ir hibridomų. Atliekamas ląstelių suliejimas, klonavimas, reklonavimas, specifiškumo tyrimas. Skiriasi selekcijos būdai. Kvadroma turi turėti du rezistentiškumo markerius. Efektyvi selekcija yra tada, kai pirmos (A) hibridomos gavimui naudojame mielominę liniją P3 x 63 Ag 8.653, rezistentišką oubainui (C29H44O12), ir kitos (B) hibridomos gavimui naudojame mielominę liniją, rezistentišką antibiotikui gentamicinui (G418). Taip gauname dvi hibridomas su skirtingais rezistentiškumo markeriais. Oubainui rezistentiška hibridoma suliejama su gentamicinui rezistentiška hibridoma ir gauta kvadroma turi du rezistentiškumo markerius. Kvadromų selekcija atliekama oubaino-gentamicino (418) terpėje. Gautos kvadromos po klonavimo ir reklonavimo produkuoja bispecifinius antikūnus.

Bispecifinų antikūnų panaudojimas

Bispecifinių antikūnų naudojimas terapijoje pagrįstas selektyvia efektoriaus ir su liga susijusio taikinio struktūrų sąveika. Antikūno molekulės tarnauja kaip tarpininkai tarp minėtų struktūrų. Monokloninių bispecifinių antikūnų molekules viena Fab dalis suriša, pvz., T ląstelių CD3 antigeną, o kita – vėžinį antigeną, kuris yra transformuotų ląstelių paviršiuje. Citotoksinių limfocitų poveikyje vyksta vėžinių ląstelių lizė. Šios reakcijos specifiškumą apsprendžia išimtinai tik bispecifinis antikūnas, nepriklausomai nuo T ląstelės specifiškumo. Yra sukonstruota įvairių bispecifinių antikūnų molekulių, kurių viena pusė yra navikui specifinė, o kita – specifinė efektorinių ląstelių (NK ląstelės, aktyvinti makrofagai, citotoksiniai T limfocitai) paviršiaus molekulėms. Tokie heterokonjugatai, prisirišę prie navikinių ląstelių, aktyvuoja efektorines ląsteles ir tokiu būdu sąlygoja navikinių ląstelių sunaikinimą. Šiuo metu vienas iš sukurtų antikūnų pavyzdžių, tai BsAb, HEA125xOKT3, kuris atpažįsta karcinominės ląstelės epitelinį antigeną EpCAM ir T ląstelės CD3 molekulę. Bispecifiniais antikūnais galima selektyviai nukreipti įvairias medžiagas, pvz.: toksinus, vaistus, citokinus, norima linkme. Viena bispecifinio antikūno Fab fragmento surišimo vieta gali būti konjuguota su chemoterapiniais vaistais (pvz., doxorubicinu) ar toksinu, o kita to paties fragmento surišimo vieta specifiškai jungiasi su vėžinės ląstelės paviršiuje esančiu antigenu. Tokiu būdu vėžinės ląstelės yra sunaikinamos ir pašalinamos iš audinio.

Rekombinantiniai antikūnai

Pastaraisiais metais plačiai pažengus baltymų inžinerijos ir ekspresijos technologijoms, pradėta konstruoti daug įvairių bispecifinių antikūnų formų. Buvo ieškoma rekombinantinių būdų, kurie įgalintų gauti kuo mažesnius bispecifinių antikūnų konstruktus, tuo būdu išvengiant antikūno Fc dalies, sukeliančios papildomą toksiškumą. Naudojant genų inžinerijos metodus, galima gauti imunoglobulinų molekulių lengvąsias ir sunkiąsias grandines kaip atskirus baltymus, sukurti įvairius antikūnų fragmentus, keisti tokias antikūnų savybes kaip afiniškumas, paratopų skaičius ir specifiškumas, domenų išsidėstymas, molekulės mobilumas, antigeno surišimo vietų erdvinis išsidėstymas, molekulinis svoris ir imunogeniškumas.

Rekombinantinių antikūnų fragmentai ir dariniai.

Skaidant ir jungiant imunoglobulino molekulę, buvo sukonstruota daug įvairių antikūnų formų. Yra žinomi šie rekombinantinių antikūnų fragmentai: F(ab‘)2, Fab‘, Fab, Fv, r IgG, Fc, scFv.

F(ab‘)2 – imunoglobulinų molekulės dalis, sudaryta iš lengvosios ir sunkiosios grandinių N galo ir lanksto srities.

Fab‘ – gaunamas skaldant F(ab‘)2 ir turi nedidelę Fc dalį. Šį fragmentą galima jungti su fermentais, toksinais ir kitais baltymais.

Fab – monovalentinis fragmentas, sudarytas iš lengvosios IgG molekulės grandinės ir sunkiosios grandinės V ir C1 domenų.

Fv – IgG fragmentas, sudarytas iš lengvosios ir sunkiosios grandinės kintamųjų domenų. Tai yra mažiausias imunoglobulino molekulės fragmentas, turintis pilną antigeno surišimo sritį.

rIgG – redukuota arba pusė-IgG molekulės, kurią sudaro viena sunkioji ir viena lengvoji IgG grandinės. Šis fragmentas gaunamas selektyviai skaldant (pvz., 2-mercaptoetanoliu) Ig molekulę, nutraukiant disulfidinius ryšius lanksto srityje. Tokie fragmentai dažniausiai ruošiami tolimesniems jų jungimams su kitomis molekulėmis.

Fc – imunoglobulinų molekulės dalis sudaryta iš abiejų sunkiųjų grandinių C2 ir C3 domenų.

scFv (angl., single-chain fragment variable) konstruojami lanksčios polipeptidinės grandinės pagalba, sujungiant lengvosios ir sunkiosios grandinės kintamuosius fragmentus (Fv), gautus iš monokloninių antikūnų scFv ekspresuojami kaip viena kovalentiškai sujungta molekulė, pasižyminti stabilumu.

Iš rekombinantinių antikūnų fragmentų yra konstruojami jų dariniai: „diabody“, triabody“, „tetrabody” Šios molekulės turi du, tris ar keturis kartu sujungtus identiškus arba skirtingus scFv antikūnų fragmentus, kurie gali būti to paties ar skirtingo specifiškumo. Šie dariniai pasižymi didesniu afiniškumu antigenui, nes padaugėja antigeną surišančių sričių, lyginant su scFv fragmentu.

Rekombinantinių antikūnų ir jų fragmentų gavimas.

Yra du skirtingi rekombinantinių antikūnų gavimo būdai. Vienas iš jų – monokloninių antikūnų ar jų fragmentų rekombinantinių analogų kūrimas, panaudojant hibridomų, produkuojančių monokloninius antikūnus, genetinę medžiagą. Kitas rekombinantinių antikūnų gavimo būdas pagrįstas bibliotekų, turinčių įvairius rekombinantinių antikūnų sekų variantus, kūrimu, t. y. norimo specifiškumo antikūnų gavimas de novo.

Rekombinantiniai antikūnai ar jų fragmentų, kurie yra identiški hibridomų gaminamiems monokloniniams antikūnams, gaunami keliais etapais: 1) bendrosios RNR išskyrimas iš hibridinių ląstelių, sekretuojančių antikūnus; 2) cDNR sintezė (atvirkštinė transkripcija); 3) lengvosios ir sunkiosios cDNR grandinės amplifikacija polimerazės grandininės reakcijos metodu; 4) molekulinių-genetinių konstruktų, turinčių cDNR, gavimas; 5) raiška atitinkamoje ekspresijos sistemoje; 6) baltymo atskyrimas ir gryninimas.

Rekombinantinių antikūnų fragmentų gavimas de novo apima tris etapus: 1) rekombinantinių antikūnų DNR bibliotekų kūrimas; 2) antikūnų fragmentų ekspresija ir pateikimas ant ląstelių paviršiaus ar fagų dalelių; 3) reikiamų antikūnų fragmentų atranka pagal jų sąveiką su antigenu. Rekombinantinių antikūnų gavimui šiuo metodu, yra naudojamos kelios ekspresijos sistemos pvz., bakterijos (E. coli), mielės (Pichia pastoris), bakulovirusai (sf9 ląstelių linija), žinduolių ląstelės (pvz., HEK293 ląstelių linija).

Rekombinantinių antikūnų panaudojimas.

Rekombinantinių antikūnų ir jų fragmentų pranašumas, lyginant su monokloniniais antikūnais, praplėtė jų pritaikymo galimybes, pirmiausiai jų panaudojimą gydymui (pvz., vėžio, autoimuninių, kvėpavimo takų, širdies ir kraujagyslių susirgimų; transpalantacijoje). Konstruojant rekombinantinius antikūnus, genų inžinerijos metodai padeda išvengti monokliniams antikūnams būdingų nepageidaujamų savybių (pvz., imunogeniškumo), kurios apsunkina jų panaudojimą klinikinėje praktikoje, ir sukurti didesnio stabilumo, specifiškumo ir afiniškumo antikūnus.

Rekombinantinių antikūnų privalumai: bakterijų auginimas yra žymiai pigesnis ir paprastesnis nei hibridomų; galima kurti žmogaus antikūnus, skirtus gydymui; nenaudojami gyvulinės kilmės produktai, todėl išvengiama potencialių patogenų, virusų rizikos; genų inžinerijos metodais galima įvairiai modifikuoti antikūno molekulę, suteikti jai norimas savybes. Trūkumai: blogas tirpumas, žemas stabilumas, nepakankamas afiniškumas antigenui.

Taip pat yra kuriami monokloniniai antikūnai, kurie funkcionuoja kaip imunotoksinai Šiuo atveju navikui specifinio monokloninio antikūno galinis konstantinio regiono domenas yra pakeistas toksino grandine. Kadangi tokie imunotoksinai neturi galinio Fc domeno, jie nesugeba rištis prie ląstelių, turinčių Fc receptorių. Jie gali rištis tik prie navikinių ląstelių ir todėl veikia, kaip labai specifiškos terapinės medžiagos.

Humanizuoti antikūnai

Šiuo metu įmanoma sukonstruoti genus, koduojančius imunoglobulinų molekules, kurių variabilusis regionas yra kilęs iš vienos organizmų rūšies, o konstantinis regionas yra kitos rūšies. Sukurti chimeriniai antikūnai, kuriuos sudaro pelės antikūno kintamos srities domenas (Fv)ir žmogaus antikūno nekintamos srities domenas (Fc). Antikūno antigeninį specifiškumą, kuris priklauso nuo variabiliojo regiono, apsprendžia pelės DNR, o izotipą – žmogaus DNR. Kadangi šių chimerinių antikūnų konstantinį regioną koduoja žmogaus genai, jų molekulė turi mažiau pelės antigeninių determinančių ir todėl pasižymi silpnesniu imunogeniškumu žmogui palyginus su pelės monokloniniais antikūnais. Humanizuotų antikūnų variabilusis regionas nepraranda savo gebėjimo formuoti atitinkamą surišimo vietą ir gali dalyvauti antigeną atpažįstant. Galima pagaminti chimerinius žmogaus–pelės antikūnus, kuriuose tik CDR sekos yra pelės kilmės. Kitas humanizuotų chimerinių antikūnų privalumas yra tas, kad jie išsaugo žmogaus antikūnų efektorines funkcijas ir gali sukelti komplemento aktyvinimą arba Fc receptoriaus surišimą.

Humanizuotų antikūnų panaudojimas

Naujos kartos vaistai – tai humanizuoti antikūnai, kurie tiksliai veikia per tam tikrus receptorius. Remiantis stebėjimais, buvo suformuluota antiangiogeninių vaistų koncepcija, pagal kurią naviko didėjimas priklauso nuo angiogenezės. Slopinant angiogenezę, galima apriboti maisto medžiagų ir deguonies tiekimą navikinėms ląstelėms, taip sukeliant jų žuvimą. Tai galima pasiekti naudojant antikūnus. Pavyzdžiui, bevacizumab (Avastin) yra humanizuotas monokloninis antikūnas prieš kraujagyslių endotelio augimo veiksnį. Šie antikūnai stabdo piktybinių navikų kraujotakos susidarymą sąveikaudamas su kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus receptoriumi, todėl jie naudojami metastazavusio kolorektalinio, nesmulkialąstelinio plaučių ir krūties vėžio terapijai. Omalizumab specifiškai suriša IgE putliųjų ląstelių paviršiuje todėl naudojamas prie alerginės astmos. Daclizumab naudojamas atliekant inkstų transplantaciją.

Katalitiniai monokloniniai antikūnai (abzimai)

Daugeliu atvejų, antikūno prisirišimas prie antigeno yra panašus į fermento prisirišimą prie substrato. Abiem atvejais prisirišimas yra silpnas, sąlygotas nekovalentinių ryšių ir pasižymi dideliu specifiškumu ir afiniškumu. Antikūno-antigeno sąveiką nuo fermento-substrato sąveikos skiria tai, kad antikūnas nepakeičia antigeno, o fermentas katalizuoja cheminius substrato pokyčius. Tačiau, kaip ir fermentai, tam tikro specifiškumo antikūnai gali stabilizuoti pririšto substrato pereinamąją būseną ir tokiu būdu sumažina substrato modifikacijai reikalingą aktyvacijos energiją. Tokie katalitiniai antikūnai, veikiantys kaip antikūnai ir kaip fermentai (enzimai) buvo pavadinti abzimais.

Katalitiniai antikūnai turi didelį potencialą farmacinėje pramonėje. Abzimai yra naudojami kokaino detoksikacijai. Yra sukurti katalitiniai antikūnai, kurie kerpa tam tikrus kokaino molekulės ryšius ir tokiu būdu eliminuoja toksinį medžiagos efektą. Abzimai prieš kokainą gali būti naudojami kaip farmacinės medžiagos narkomanams gydyti ir esant perdozavimui. Abzimai gali būti naudojami virusų inaktyvacijai. Yra surasti abzimai, kurie skelia žmogaus imunodeficito viruso apvalkalo baltymus.

Pagrindiniai diagnostikos metodai sukurti naudojant monokloninius antikūnus

Imunofluoroscencija

Imunofluorescencijos metodo pagalba galima tirti ląstelių paviršiaus struktūras. Specifiniai antikūnai konjuguoti su fluorochromu rišasi su ląstelių membranos antigenais ir tiriant tokias ląsteles fluorescenciniu mikroskopu stebimas švytėjimas. Naudojami įvairūs imunofluorescencijos būdai: tiesioginė ir netiesioginė, membraninė ir citoplazminė, vienspalvė ir dvispalvė. Antikūnai gali būti konjuguoti su vienu ar keliais skirtingais fluorochromais: fluoresceinizotiocianatu (FITC) ir tetrametilrodaminizotiocianatu (TRITC). FITC-u pažymėtas kompleksas švyti žalia spalva, o TRITC-u raudona spalva. Mikroskopuojant naudojami skirtingi šviesos filtrai ir stebima dvispalvė imunofluorescencija.

Radioimuninė analizė (RIA)

Metodo esmė yra konkurencinė sąveika radioaktyviu izotopu žymėto antigeno ir to paties nežymėto antigeno su jam specifiniais antikūnais. Reakcija vertinama, matuojant laisvo arba sujungto antigeno radioaktyvumą. Metodas taikomas labai mažų antigeno koncentracijų (10-12 g/ml) aptikimui, pvz., hormonų. RIA praktikoje nėra plačiai taikomas, nes jį pakeitė saugesni ir jautrumu nenusileidžiantys metodai.

Imunofermentinės analizė (ELISA)

Metodo esmė yra ta, kad tirpale susidaro antigenų-antikūnų kompleksai, kurie išryškinami antikūnais, žymėtais fermentu (konjugatu). Fermentas skaldo chromogeninį substratą, gaunama spalvinė reakcija, kuri vertinama matuojant reakcijos tirpalo optinį tankį. ELISA atliekama specialiose mikroplokštelėse, turinčiose 96 šulinėlius, todėl reikalingi nedideli reakcijos komponentų kiekiai. Yra keletas ELISA variantų: netiesioginė, tiesioginės, „sumuštinio“ (angl., sandwich) tipo, ląstelių (CELISA). Imunofermentinės analizės metodų jautrumo padidinimui, naudojama avidino-biotino sistema. Imunofermentinė analizė plačiai naudojama įvairiuose biologiniuose tyrimuose, nustatant antikūnus arba antigenus įvairiuose biologiniuose skysčiuose (kraujo serume, seilėse, piene ir kt.). Metodas dažnai taikomas laboratorinėje ligų diagnostikoje.

Imunodotas

Tai yra netiesioginės imunofermentinės analizės metodo variantas, kurio esmė ta, kad antigenas yra adsorbuojamas ant nitroceliuliozinės membranos, po to eilės tvarka užnešamas tiriamasis serumas (antikūnai), antriniai antikūnai, žymėti fermentu, ir fermento substratas. Esant teigiamai reakcijai, ant nitroceliuliozės susidaro dėmės, pagal kurių spalvos intensyvumą galima spręsti apie antikūnų buvimą ir jų kiekį kraujyje. Ant nitroceliuliozės galima adsorbuoti antikūnus bei kitas imunologiškai aktyvias medžiagas. Imunodoto privalumas yra tas, kad yra naudojami minimalūs antigeno arba antikūno kiekiai. Be to, šis metodas nereikalauja sudėtingos aparatūros ir įrenginių, todėl gali būti naudojamas greitam daugelio antigenų kokybiniam nustatymui.

Imunoblotingas

Western blotingas atliekamas naudojant imunologiškai aktyvias medžiagas – antikūnus ir antigenus. Šio metodo principas yra tas, kad baltymai iš elektroforetinių gelių yra perkeliami ant netirpaus nešėjo ir čia imobilizuojami. Tokiu būdu, ant netirpaus nešėjo atsiranda tiksli elektroforegramos kopija. Perkėlimo metu baltymai nedenatūruoja, o tai leidžia toliau tyrinėti jų biologinį aktyvumą. Blotogramos analizuojamos naudojant žymėtus antikūnus. Dabartiniu metu žinomi keli biopolimerų blotingo (perkėlimo) būdai: kontaktinis-difuzinis, buferio tėkmės ir elektroforetinis. Imunoblotingo metodas yra plačiai naudojamas antigeno-antikūno sąveikai tirti, infekcinių ligų diagnostikai, imuninio atsako dėsningumams išaiškinti.

Metodai, sukurti panaudojant monokloninius antikūnus, yra labai jautrūs ir įgalina nustatyti 100-20pg specifinio antigeno, todėl naudojami daugelio susirgimų diagnostikoje.

Antikūnai gali būti naudojami įvairių ląstelių populiacijų atskyrimui.

Ląstelių adhezija Petri lėkštelėse; T-limfocitų išskyrimas citolizės būdu. Limfocitų išskyrimas magnetinių nanodalelių pagalba (MACS metodas) ir kt.

Citoterapija

Citoterapija (ląstelių terapija), kurios metu suaugusiame organizme pažeistos ląstelės pakeičiamos sveikomis, yra vienas iš perspektyvių įvairių ligų gydymo būdų. Kamieninių ląstelių transplantacija į organizmą yra patogi tuo, kad ląstelės gali būti paimtos iš to paties organizmo, taigi, po manipuliacijų ex vivo, jos grąžinamos į organizmą, nesukeldamos imuninio atsako. Kamieninės ląstelės gali daugintis in vitro ir tai leidžia jas genetiškai modifikuoti norimais būdais.

Hemopoetinės kamieninės ląstelės (HKL)

Tai multipotentinės ląstelės, kurios geba dalintis ir formuoti visų tipų kraujo ląsteles. Vystantis vaisiui, hemopoezė vyksta trynio maišelyje, kepenyse, blužnyje ir kaulų čiulpuose. Suaugusiame organizme HKL šaltiniai yra kaulų čiulpuose su dideliais kiekiais dubenyje, šlaunies ar krūtinkaulio kaule. HKL taip pat aptinkamos nedideliais kiekiais periferiniame kraujyje ir virkštelėje. Hemopoetinių kaulų čiulpų kamieninių ląstelių transplantacija jau daugiau kaip 35 metus sėkmingai naudojama gydant leukemija, limfoma ir mieloma sergančius pacientus. Kraujo ligų gydymui yra naudojami ir kiti kamieninių ląstelių šaltiniai – naujagimio virkštelės kraujas ir periferinis kraujas.

 

Hematopoetinių kamieninių ląstelių transplantacija

Per pastaruosius du dešimtmečius padaryta didžiulė pažanga kamieninių ląstelių srityje, t.y. gydant įvairius susirgimus, tarp jų ir tuos, kurie sutrikdo normalią kraujodarą.

Hematopoetinių kamieninių ląstelių transplantacija – rizikingas ir dažnai komplikuotas įvairių, dažniausiai vėžinių, hematologinių (su kraujodara susijusių) susirgimų gydymo būdas. Nors pirmiausia jis buvo taikomas nukentėjusių nuo radiacijos gydymui, šiuo metu šiuo metodu gydomos įvairios leukemijos, limfomos (limfmazgių vėžio), anemijos formos, mieloma, taip pat neuroblastoma (simpatinės nervų sistemos vėžys) bei retinoblastoma (tinklainės vėžys). Siekiant transplantaciją įvykdyti sėkmingai būtina pasiekti tris pagrindinius tikslus:

  • tinkamai paruošti recipientą kamieninių ląstelių prigijimui: taikoma intensyvi chemoterapija, dažnai lydima radioterapijos;
  • tinkamai parinkti donorą ir paruošti kamienines ląsteles;
  • supresuoti recipiento imuninę sistemą po transplantacijos.

Gali būti vykdoma dviejų tipų kamieninių ląstelių transplantacija:

  • Autogeninė, kurios metu transplantuojamos paties paciento kamieninės ląstelės;
  • Alogeninė, kai donoras yra kitas asmuo, kurio žmogaus leukocitų antigenai atitinka recipiento.

Autogeninė transplantacija dažnai pasireiškia mažesne atmetimo bei įvairių kitų neigiamų pasekmių tikimybe ir dažniausiai naudojama daugybinės mielomos (plazminių ląstelių naviko), kitų plazminių ląstelių susirgimų ar limfomų atvejais. Alogeninė transplantacija taikoma leukemijų, limfomų ir kitų kaulų čiulpų funkcijos sutrikimų atveju.

Alogeninė transplantacija gali turėti įvairių komplikacijų, tarp jų su transplantanto atmetimu susiję padariniai, dažnai sukeliantys recipiento mirtį. Didelis dėmesys skiriamas „transplantanto prieš šeimininką“ ligai, kurios metu donoro ląstelės ima kovoti su nusilpnintu recipiento organizmu, kai antigenus pateikiančios recipiento ląstelės donoro T limfocitams pateikia savus antigenus.

Kamieninės ląstelės vėžio terapijoje

Viena iš sunkiausių smegenų vėžio formų – glioblastoma arba kitaip piktybinė glioma. Nepaisant didelių pastangų, gydant šią ligą, pacientų išgyvenamumas tesiekia 14,6 mėnesių, o tik apie 10 % išgyvena apie 5 metus taikant chemoterapiją su temozolamidu, radioterapiją bei smegenų operaciją. Šios ligos gydymo nesėkmę daugiausiai lemia glioblastomos nevaldomas invazinis augimas bei didelis paplitimas smegenų parenchimoje. Smegenų vėžio terapijoje gali būti naudojamos įvairios nervų kamieninės, multipotentinės mezenchiminės stromos ir hemopoetinės ląstelės.

Nervų kamieninės ląstelės (NKL) diferencijuojasi iš ektodermos ląstelių ir gaunamos iš besivystančio embriono neuroepitelio. Suaugusiame žmoguje jos lokalizuotos hipokampe. Nauji neuronai nuolat susidaro iš nervinių pirmtakinių ląstelių, aptinkamų hipokampo dantytajame vingyje, kurios visą organizmo gyvavimo laiką pasižymi mitoziniu aktyvumu. Patys pirmieji tyrimai parodė, kad persodintos NKL geba migruoti ir įveikti ilgas distancijas bei aptikti vėžines ląsteles, t. y. sekti jų pėdsakais ir migruoti ten, kur yra vėžinės ląstelės. Nervinės kamieninės ląstelės ir mezenchiminės pasižymi vėžio tropizmu, t. y. migruoja ten, kur yra vėžinės ląstelės. Daugiausiai tropizmas nustatytas tyrinėjant piktybinius smegenų auglius.

Saugumas ir kamieninių ląstelių šaltiniai – pagrindiniai aspektai, keliantys iššūkių panaudojant kamienines ląsteles vėžio terapijoje. Pagrindinis uždavinys, ieškant kamieninių ląstelių šaltinių, būtų rasti autologines, ne imunogeniškas, lengvai gaunamas ląsteles, kurios atitiktų etinius reikalavimus. Taip pat jomis būtų lengva atlikti manipuliacijas in vitro, nereikalaujant imortalizacijos, kuri galėtų būti priežastis de novo auglio susiformavimui. Kitaip tariant, sukeliant somatinių ląstelių diferenciacijos regresiją ir paverčiant jas pliuripotentinėmis. Taigi kamieninių ląstelių galimybė migruoti ten, kur telkiasi vėžinės ląstelės, yra puiki ateities medicinos galimybė, pernešant į navikus apoptozę indukuojančius baltymus, imunostimuliacijos signalus, onokoltinių virusų daleles ar kitas medžiagas, veikiančias vėžines ląsteles.

Mezenchiminės ląstelės (MKL)

Dar kitaip vadinamos multipotentinėmis stromos ląstelėmis gaunamos iš kaulų čiulpų stromos. Jos geba diferencijuotis į: osteoblastus, chondrocitus, miocitus, adipocitus.

Mezenchiminių kamieninių ląstelių taikymas terapijoje pastaraisiais metais susilaukia vis didesnio susidomėjimo. Viena iš jų potencialaus taikymo sričių – inkstų pažeidimų taisymas ir regeneracija. Inkstai – labai sudėtingas organas, sudarytas iš daugiau nei 30 skirtingų ląstelių tipų, išsidėsčiusių skirtinguose kompartmentuose. Šioms ląstelėms priklauso kanalėlių epitelinės ląstelės, intersticinės, glomerulių ląstelės, kurios skiriasi savo proliferacijos greičiu, kiekiu ir regeneracijos potencialu. Net skirtinguose nefrono, mažiausio inkstų funkcinio vieneto, kompartmentuose egzistuoja skirtingos regeneracijos galimybės. Pavyzdžiui, podocitai – glomerulių visceralinio epitelio ląstelės – yra negrįžtamai diferencijuoti ir jų proliferacija lygi nuliui. Jei podocitai prarandami vykstant nekrozei ar apoptozei, jie nėra pakeičiami kitais, kurie galėtų susidaryti proliferuojant kaimyniniams podocitams. Tuo tarpu proksimalinių kanalėlių ląstelės į žalingą poveikį atsako difuzine proliferacija. Manoma, kad mezenchiminės kamieninės ląstelės gali dalyvauti glomerulių regeneracijoje ir padėti pašalinti kanalėlių pažeidimus Glomerulės ir iš jų išeinantys kanalėliai, kurie baigiasi inkstų geldelėje, yra pagrindinė inkstų sudedamoji dalis. Vykstant kraujo filtracijai, glomerulių kanalėliuose naudingos medžiagos įsiurbiamos atgal į organizmą, o kenksmingos pašalinamos su šlapimu, todėl, sutrikus glomerulių ir kanalėlių funkcijoms ar atsiradus struktūros pakitimams, gali sutrikti viso organizmo homeostazė

Iš kaulų čiulpų išskirtos kamieninės ląstelės siejamos su inkstų audinio taisymu. Jos įsikuria pažeistuose nefronuose ir veikia tiesiogiai arba netiesiogiai per parakrininį ar endokrininį mechanizmą. Tyrimai parodė, kad esant ūminiams inkstų pažeidimams kamieninės ląstelės gali atstatyti tiek glomerulių, tiek kanalėlių pažeidimus.

Žinduolių inkstų regeneracijai būdingi trys variantai: 1 – pakartotinis inkstų parenchiminių ląstelių ciklas į diferencijuotas ląsteles; 2 – tiesioginė transdiferenciacija iš vieno ląstelių tipo į kitą (pvz., kanalėlių ląstelės diferencijuojasi į intersticines ląsteles) ir 3 – diferenciacija iš kamieninių ląstelių populiacijos, esančios inkstuose ar kaulų čiulpuose. Inkstams gydyti gali būti taikomos keturių skirtingų tipų kamieninės ląstelės: nefrakcionuotos kaulų čiulpų ląstelės, hemopoetinės kamieninės ląstelės, mezenchiminės kamieninės ląstelės ir pačiuose inkstuose esančios reziduojančios ląstelės.

Modifikuotos mezenchiminės ląstelės vėžio terapijoje

Mezenchiminės ląstelės gali būti naudingos transportuojant onkolitinius adenovirusus į navikus. Suaugusio žmogaus mezenchiminės ląstelės padeda adenovirusui replikuotis. Virusai turi timidino kinazę, kuri pasižymi in vivo pašaliniu efektu prieš skirtingas vėžio ląstelių linijas. Naudojant pelių modelius, intraveniškai į peles buvo suleista adenovirusus produkuojančios mezenchiminės ląstelės prieš kiaušidžių vėžį. Ląstelės pasižymėjo antivėžiniu efektu. Tokie patys rezultatai buvo stebėti pelių modeliuose su metastazėmis plaučiuose prieš plaučių vėžį. Mezenchiminės ląstelės gali būti transdukuojamos su interleukinu-2, taip sustiprinant antivėžinį efektą. Taigi MKL gali būti alternatyva suaugusio žmogaus nervinėms kamieninėms ląstelėms, kurių izoliavimas iš suaugusio žmogaus negalimas.

Mezenchiminių kamieninių ląstelių transplantacijos įtaka sisteminei raudonajai vilkligei (SRV)

Sisteminė raudonoji vilkligė yra autoimuninė liga, kuri nepaisant pažangos ir imunosupresinės terapijos vis dar išlieka mirtina. Ji sukelia daugybinius organų pažeidimus: pažeidžiami inkstai, širdis ir kraujagyslės, nervai, raumenys ir oda. Eksperimento metu tirtos MRL/lpr pelės pasižymėjo nefritu, glomerulių bazalinės membranos uždegimu, mesangialinių ląstelių (inkstų glomerulėse esantys fagocitai) padidėjusiu augimu. Tyrimų metu buvo parodyta, kad MSCs transplantacija sumažina proteinuriją (būklė, kai šlapime yra baltymų), serumo kreatino, antikūnų prieš dvigrandę DNR lygį bei pusmėnulių (šių struktūrų formavimosi greitis leidžia įvertinti inkstų pažeidimus) formavimosi greitį palyginus su kontroline grupe. Buvo nustatyta, kad autoantikūnai vaidina pagrindinį vaidmenį įvairiai pažeidžiant organų funkcijas.

Šio susirgimo atveju pacientuose randamas žymiai padidėjęs šių cirkuliuojančių autoantikūnų, specifinių dvigrandei DNR, kiekis, kuris įvykdžius MSCs transplantaciją sumažėja, palyginus su kontroline grupe.

Taip pat buvo pasiūlyta idėja, kad CD4+CD25+Foxp3+ T ląstelės padeda išvengti autoimuniškumo. Norint įvertinti UC-MSCs poveikį tregams, buvo ištirtos Foxp3+ T ląstelės MRL/lpr pelių blužnyje. Tėkmės citometrijos tyrimai parodė, kad CD4+ CD25+Foxp3+ T ląstelių daugiau buvo tų pelių blužnyje, kurios buvo gydytos UC-MSCs. Gydymas BM-MSCs tyrimo metu taip pat padidino CD4+CD25+Foxp3+ T ląstelių kiekį MRL/lpr pelėse. Natūralūs CD4+CD25+Foxp3+ tregai ekspresuoja transkripcijos faktorių Foxp3, kuris kontroliuoja jų dalijimąsi ir funkcijas. Funkciniai trūkumai Foxp3 gene sukelia tregų nebuvimą. SLE ligoniuose randami maži šių ląstelių kiekiai, arba šios ląstelės turi funkcinių defektų. Inkubavus CD4+ ląsteles su UC-MSCs ir be jų santykiu 1:1 buvo nustatyta, kad MSCs reguliuoja tregų veiklą. Abiem atvejais tregų procentingumas ir Foxp3+ lygis buvo žymiai padidėjęs toje pelių grupėje, kuri buvo gydyta UMSCs .

Kaip jau minėta anksčiau, sisteminė raudonoji vilkligė yra autoimuninė liga, kurios rezultatas – nefritas, o vėliau inkstų mikrostruktūros suardymas. MSCs pasižymi imunomoduliacinėmis savybėmis. Jos yra hipoimunogeninės ląstelės, kurios dažniausiai neekspresuoja MHC-II ir kostimuliacinių molekulių. Yra parodyta, kad MSCs gali palengvinti imuninį atsaką, slopindamos priešuždegiminius citokinus ir priešuždegiminę aplinką pakeisdamos į anti-uždegiminę, kai slopinamas Th1 ląstelių plitimas ir skatinama antiuždegiminių Th2 ląstelių veikla. MSCs transplantacija sukelia citokinų profilio iš Th1 į Th2 pasikeitimą, kuris lemia IFN-γ, IL-2, TNF-α , IL-6, IL-12 kiekio sumažėjimą serume, o IL-4 ir IL-10 lygis padidėja. In vitro eksperimentais buvo parodyta, kad MSCs slopina limfocitų ir splenocitų proliferaciją, tačiau neinhibuoja mesangialinių ląstelių proliferacijos. Nors ilgalaikis ląstelių prigijimas inkstuose nepastebėtas, tačiau MSCs transplantacija padeda sumažinti inkstų uždegimą, kadangi slopinama priešuždegiminių citokinų gamyba. Šie eksperimentai įrodo, kad MSCs gali būti naudojamos inkstų funkcijoms atstatyti. MSCs gali sumažinti inkstų pažeidimų žalą, specifiškai atstatydamos inkstų glomerulių struktūrą. Žiurkių modelyje buvo parodyta, kad kraujo perpylimas suaugusiųjų MSCs paspartina glomerulių gijimą, esant proliferuojančiam glomerulonefritui. Glomerulonefritas – tai grupė inkstų ligų, turinčių imunologinį mechanizmą, kuris pažeidžia glomerules ir sukelia jų uždegimą ir glomerulinių audinių išvešėjimą

Remiantis šiais rezultatais, manoma, kad alogeninių MSCs transplantacija gali būti puiki priemonė gydant sisteminę raudonąją vilkligę.

Šiuo metu kaulų čiulpų MSCs sudaro pagrindinį MSCs ląstelių šaltinį, tačiau jos turi ribotą diferenciacijos potencialą, kuris mažėja sulig amžiumi, todėl siekiama naudoti virkštelės mezenchimines ląsteles, kadangi jos gali būti renkamos nesukeliant skausmo donorui ir pasižymi didesniu proliferacijos potencialu.

Mezenchiminės kamieninės ląstelės ir ūmus inkstų pažeidimas

Sąvoka ūminis inkstų pažeidimas apibūdina staigų ir ilgalaikį filtracijos, kurią atlieka inkstų glomerulės, sumažėjimą, kuris sukelia metabolitų susilaikymą organizme. Charakteringiausias pažeidimas yra kanalėlių nekrozė ir apoptozė, kurios sukelia kanalėlių obstrukciją, intersticinių ląstelių padidėjimą ir proteolitinių baltymų aktyvaciją. Daugeliui sergančių AKI yra reikalinga dializė. Komplikacijos atsiranda inkstams nesugebant regeneruoti atsiradusius pažeidimus kanalėlių epitelinėse ląstelėse. Nesugebėjimas pakeisti pažeistas ląsteles sukelia kanalėlių-intersticinių ląstelių fibrozę ir randus, kurie didina galimybę išsivystyti lėtiniams inkstų pažeidimams. Tyrimais buvo įrodytas iš kaulų čiulpų išskirtų ląstelių gebėjimas diferencijuotis į inkstų epitelio ląsteles. Keli autoriai nagrinėjo galimybę, kad iš kaulų čiulpų išskirtos ląstelės susilieja su kanalėlių epitelio ląstelėmis, o tyrimais buvo parodyta, kad kaulų čiulpų ląstelės integruojasi į inkstų epitelį (apie 10 %). Nekroziniai pakitimai proksimaliniuose ir distaliniuose kanalėliuose gali lemti mezenchiminių kamieninių ląstelių (MSC) migraciją į inkstus. Injekuotos MSC dažniausiai randamos jungiamojo audinio tarpsluoksniuose (interstitium), o po to kanalėliuose ir endotelyje.

MSC gamina augimo faktorių, kuris skatina kanalėlių epitelio ląstelių išgyvenamumą, dediferenciaciją ir vėlesnę proliferaciją bei rediferenciaciją. Taip pat gali būti tiesiogiai veikiamos rezidentinės kamieninių ląstelių populiacijos. Vėlesni faktoriai gali slopinti uždegimą. MSC taip pat gali diferencijuotis į kanalėlių epitelio ląsteles ir atstatyti pažeistus kanalėlius. B atveju MSC gamina faktorių, tokį kaip, pvz., VEGF (kraujagyslių endotelio augimo faktorių) ir TGF-β, kurie gali paspartinti glomerulių regeneraciją. Kita vertus, MSC gali diferencijuotis į glomerulių ląsteles

Naujausi tyrimai sutelkti į mezenchiminių kamieninių ląstelių pritaikymą įvairių inkstų ligų gydymui ar galimybę išvengti sunkių inkstų pažeidimų. Tyrimais taip pat patvirtinta, kad kaulų čiulpų ir hemopoetinių kamieninių ląstelių transplantacija gali lemti inkstų funkcijų išsaugojimą. Manoma, kad MSC gali veikti per parakrininį poveikį, o ne prigydamos ir proliferuodamos. In vitro MSC į aplinką ekspresuoja VEGF, kuris yra kritinis faktorius glomerulių funkcijoms.

Taigi, mezenchiminės kamieninės ląstelės – grupė ląstelių, kurių transplantacija gali būti taikoma kaip efektyvi gydymo priemonė. 2009-2011 metų tyrimai rodo galimybę šias ląsteles, išskirtas iš kaulų čiulpų ar virkštelės, taikyti inkstų pažaidų regeneracijai. Mezenchiminės kamieninės ląstelės, išskirtos iš virkštelės, pasižymi platesniu proliferacijos potencialu, be to, jas lengviau ir paprasčiau išskirti, nesukeliant skausmo donorui ir jų taikymas medicinoje yra puiki ateities alternatyva iki šiol naudojamiems gydymo būdams. Taikant gydymą MSCs inkstų pažeidimų atveju, sumažėja proteinurija, serumo kreatino, antikūnų prieš dvigrandę DNR lygis, pusmėnulių formavimosi greitis, uždegiminė aplinka keičiama į antiuždegiminę, tačiau visgi, norint taikyti šį metodą praktikoje, dar reikalingi išsamesni tyrimai, kadangi pelių ar žiurkių modeliai gali nepasiteisinti žmonių atveju ir sukelti šalutinių poveikių.

Uždegimas

Uždegimas – tai apsauginė vietinė kraujagyslių, jungiamojo, nervinio audinio, humoralinių ir ląstelinių veiksnių reakcijų visuma į pažaidą. Uždegimas yra apsigynimo- adaptacinė organizmo reakcija, priskiriama tipiškiems patologiniams procesams, kuriuos sukelia egzogeniniai ir endogeniniai veiksniai. Vis dažniau mirgant straipsniams apie uždegiminių reakcijų sąsają su vėžiniais susirgimais, aktualia tema tampa uždegiminėje reakcijoje dalyvaujančių mediatorių ir kitų ląstelių, tokių kaip kamieninės ar vėžinės ląstelės, sąveika. Kalbant apie uždegimines reakcijas, čia pagrindinį vaidmenį atlieka integrinai, citokinai, transkripcijos faktoriai ir branduolio kapa faktorius (NFκB) bei jo signalinis kelias. Išsiaiškinti mediatorių veikimą tampa vienu pagrindinių šiuolaikinės medicinos uždavinių, siekiant surasti efektyvų gydymo metodą tokioms ligoms kaip diabetas, plaučių edema, metabolinis sindromas, vėžys. Mokslininkai bando rasti ryšį tarp vėžinių susirgimų ir chroninių uždegiminių procesų. Daugelio tyrimų metu buvo nustatyta nekontroliuojama ląstelių proliferacija uždegiminėse srityse ir atvirkščiai – uždegiminių ląstelių aptikta vėžio paveiktuose audinių regionuose. Pavyzdžiui, karcinogenai, rasti maisto produktuose, gali sukelti uždegimą, išsivystantį į vėžinius susirgimus. Po daugybės atliktų bandymų nustatyta, jog viena iš penkių vėžio sukeltų mirčių yra dėl chroninės uždegiminės reakcijos metu susiformavusių piktybinių navikų. Todėl uždegiminių reakcijų ir jose dalyvaujančių mediatorių slopinimas ankstyvojoje stadijoje gali sumažinti onkologinių susirgimų tikimybę, o terapijoje panaudojamos kamieninės ląstelės – pagrindiniu gydymo būdu kovoje su vėžiu.

Kasos regeneracija kamieninėmis ląstelėmis

Kasos regeneracijos procese didžiausias dėmesys skiriamas β ląstelėms, nes jos atsakingos už insulino sekreciją. Sutrikdžius šių ląstelių natūralią pusiausvyrą organizme pasireiškia gliukozės koncentracijos sutrikimai − hiperglikemija (padidėjusi gliukozės koncentracija), tai veda į cukrinio diabeto susirgimus. Todėl intensyviausiai tiriama β ląstelių regeneracijos galimybės. Nesutariama, ar β ląstelių regeneracija in vivo vyksta dėl pačių β ląstelių išsaugoto gebėjimo dalintis, ar regeneracijos procese suaugusiame organizme dalyvauja tik kamieninės ląstelės. Yra įrodyta, kad pelėse atlikus 70 % kasos pašalinimo operaciją, β ląstelių populiacija atsistato iš likusių β ląstelių, o ne iš kamieninių ląstelių.

Tačiau yra ir priešingų įrodymų, kad kasos regeneracija vyksta ir neogenezės keliu (naujos Largenhanso salelėse esančios ląstelės kyla iš ląstelių pirmtakių arba kamieninių ląstelių). Manoma, kad abu procesai gali vykti vienu metu. Tai buvo pastebėta vykstant kasos regeneracijai po sukeltų pažeidimų. Yra žinoma, kad tam tikromis aplinkybėmis insuliną gali sekretuoti ne vien β ląstelės, bet ir kitos ląstelės ir audiniai. Buvo atrastos multipotentinės kamieninės ląstelės galinčios sekretuoti insuliną, šios ląstelės rastos suaugusiose pelėse, jų embrionuose ir žmogaus kasoje. Taip pat buvo parodyta, kad šios ląstelės geba save atnaujinti ir ekspresuoja Pdx1, Nkx6.1, Ngn3 žymenis.

Didelis dėmesys skiriamas embrioninėms kamieninėms ląstelėms (EKL) ir jų panaudojimui regeneruojant organus, dėl EKL gebėjimo dalintis neribotai ir išlikti nediferencijuotoje stadijoje, bei galimybės jas diferencijuoti į bet kokio audinio ląsteles. Pasinaudojant šiomis žiniomis buvo parodyta, kad tiek pelės, tiek žmogaus EKL galima diferencijuoti į endodermos ląsteles, kurias toliau galima diferencijuoti į kasos ląsteles.  Bandant EKL diferencijuoti į kasos ląsteles susiduriama su problema, kokiu keliu ir kaip diferencijuoti EKL iki kasos ląstelių. Yra pastebėta, kad, naudojant net tos pačios linijos EKL ir skirtingus diferencijacijos protokolus siekiant EKL diferencijuoti į insuliną galinčias sekretuoti ląsteles, gaunami skirtingi eksperimentų rezultatai. Pavyzdžiui tiriant diferencijuotas ląsteles pastebima, kad pagal vieną protokolą gautos ląstelės geba sekretuoti insuliną, bet nereaguoja į gliukozės koncentraciją terpėje, kai natyvių β ląstelių sekretuojamo insulino koncentracija tiesiogiai proporcinga gliukozės koncentracijai.

Diferencijavus EKL iki insuliną gebančių sekretuoti ląstelių yra tik pirminė stadija. Sekanti stadija būtų patikrinimas, ar in vivo šios ląstelės sugeba sekretuoti insuliną, palaikyti gliukozės homeostazę, išsiaiškinti, kiek ilgai in vivo išlieka transplantuotos ląstelės, ar nesukelia šalutinio poveikio. Tikrinant šiuos etapus gaunama daug skirtingų ir įvairių rezultatų, iškyla naujų problemų. Transplantavus ląsteles, kurios in vitro produkavo insuliną ir reagavo į gliukozės koncentraciją, organizme jos gali elgtis priešingai ir neduoti laukiamo efekto. Dažnai būna, kad ląstelės nesugeba kontroliuoti gliukozės koncentracijos ar tik iš dalies ją kontroliuoja ir sušvelnina diabeto požymius pelių modeliuose. Taip pat pastebėta, kad, praėjus tam tikram laiko tarpui, gliukozės koncentracija pelėse pradeda didėti, tai rodo, kad transplantuotos ląstelės nyksta arba jos palaipsniui nustoja sekretuoti insuliną. Tikslus mechanizmas nėra žinomas. Ir visa tai priklauso nuo to, kokiu būdų EKL buvo diferencijuotos iki insuliną produkuojančių ląstelių. Vienas sėkmingiausių protokolų pelių EKL diferencijuoti iki insuliną produkuojančių ląstelių būtų Blyszcuk’o protokolas, kuris susideda iš trijų žingsnių:

  1. Embrioninių kūnelių formavimas.
  2. Spontaninė embrioninių kūnelių diferencijacija į ektodermos, mezodermos ir endodermos ląstelių linijas perkeliant embrioninius kūnelius ant želatina dengtų lėkštelių.
  3. Indukcija iki insuliną produkuojančių ląstelių kultivuojant ląsteles terpėje su progesteronu, lamininu, putrescinu, selenu, nikotinamidu, insulinu, transferinu ir B27.

Naudojant šitą protokolą ir ES122 EKL liniją gautos ląstelės buvo transplantuotos pelėse, sergančiose diabetu. Po transplantacijos pelėse atsistatė gliukozės homeostazė, tačiau buvo šalutinis poveikis, teratomų formavimasis. Naudojant EKL teratomų formavimas po transplantacijos gan dažnas reiškinys, tai vienas iš labiausiai ribojančių faktorių EKL naudojimą transplantacijoje. Manoma, kad teratomų formavimosi būtų galima išvengti labiau diferencijuojant EKL. Šitai pasiekti in vitro nepavyksta, nes nėra žinomi visi diferenciacijos faktoriai, todėl gaunamos tik dalinai diferencijuotos ląstelės. Taip pat manoma, kad teratomų formavimą būtų galimą panaikinti atlikus transplantuojamų ląstelių atranką ir pašalinant silpnai ar nediferencijuotas EKL panaudojant paviršiaus žymenis. Apibendrinant galima teigti, kad kamieninių ląstelių panaudojimas regeneruojant kasą yra realus. Tačiau, kad būtų pasiektas klinikinis gydymo lygis, dar reikia išsiaiškinti daug klausimų ir problemų sprendimo būdų. Reikia sukurti standartinį metodą diferencijuojant embrionines ir indukuotąsias kamienines ląsteles. Taip pat užtikrinti, kad nebūtų jokio teratomų formavimosi ar kitų šalutinių poveikių.

Kepenų regeneravimas kamieninėmis ląstelėmis

Viena iš pagrindinių tam tikram audiniui būdingų kamieninių ląstelių savybių yra gebėjimas atkurti pažeisto audinio funkcijas. Transplantuotos kamieninės ląstelės gali integruotis ir pakeisti 50 % visos kepenų ląstelių populiacijos.

Viena iš pagrindinių hepatocitų savybių yra gebėjimas efektyviai dalintis, ko, pavyzdžiui, negali kraujo ląstelės. Perkėlus hepatocitus donorinei pelei, pastebėta, jog apie 70 % perkeltos ląstelių populiacijos pradeda dalintis. Paprastai perkelti hepatocitai gali dalintis iki 30 kartų, neprarasdami savo funkcijos. Taip pat galima izoliuoti ir poliploidinius hepatocitus, kurie turi dar didesnį gebėjimą proliferuoti. Įdomu tai, kad buvo pastebėtas jau subrendusių hepatocitų bipotentiškumas. Eksperimento metu nustatyta, kad hepatocitai gali diferencijuoti į tulžies latakų ląsteles. Taigi galima teigti, kad hepatocitai pasižymi kamieninių ląstelių savybėmis. Tiriama kepenų regeneracijos galimybė, panaudojant ne tik hepatocitus, bet ir kitas ląsteles, pavyzdžiui, vaisiaus hepatoblastus, kasos ląsteles, mezenchimines kamienines ląsteles ir kitas.

Vaisiaus vystymosi metu, kepenų formavimosi srityse aptinkami hepatoblastai. Jie gali būti interpretuojamos kaip vaisiaus kepenų kamieninės ląstelės, kurios geba diferencijuoti į hepatocitus bei tulžies latakų ląsteles. Tiriant žiurkių embrioninius hepatoblastus 12–14 vystymosi dienomis, buvo identifikuotos trys hepatoblastų populiacijos. Viena grupė pasižymėjo bipotencinėmis savybėmis, o likusios dvi unipotentinės, vienos diferenciavo į hepatocitus, o kitos į tulžies latakų ląsteles.

Kepenų ovaliosios ląstelės pasižymi bipotentiškumu ir gali diferencijuotis į hepatocitus bei tulžies latakų ląsteles. Atlikus graužikuose šių ląstelių transplantaciją, pastebėtas jų efektyvus gebėjimas diferencijuoti į subrendusius hepatocitus.

Manoma, kad kasos ir kepenų ląstelės turi bendrą kilmę. Atitinkamai paveikus graužikų kasos ląstelių pirmtakes, jos gali diferencijuoti į hepatocitus. Manoma, kad kasoje egzistuoja kepenų ląstelių pirmtakės. O taip pat kepenyse galima rasti kasos ląstelių pirmtakių. Taip pat nustatyta, kad ovaliosios ląstelės gali diferencijuoti į kasos ląsteles, kurios produkuoja insuliną. Tokia kasos regeneracija buvo sėkmingai atlikta pelėms. Įdomu tai, kad tam tikrų transkripcijos faktorių perteklius gali nulemti ląstelių, kurios produkuoja insuliną, atsiradimą.

Graužikams buvo transplantuotos žmogaus mezenchiminės ląstelės iš virkštelės, riebalinio audinio bei kaulų čiulpų ir pastebėta gana efektyvi kepenų regeneracija, esant sužeidimui. Taip pat efektyviai veikia ir kitas metodas, kuomet mezenchiminės kamieninės ląstelės diferencijuojamos į hepatocitus in vitro ir tik po to transplantuojamos. Tačiau yra duomenų, kad terapija tokiomis ląstelėmis gali sukelti kepenų cirozę.

Nepaisant gautų teigiamų rezultatų tiek su modeliniais organizmais, tiek su žmogumi, nėra aišku, kurios kepenų ląstelės galėtų būti efektyviausiai panaudotos kepenų regeneracijoje. Pati kepenų ląstelių klasifikacija nėra pakankamai aiški, reikalingi detalesni tyrimai, kurie patvirtintų tam tikrų kepenų ląstelių populiacijų funkcijas ir reikšmę kepenų regeneracijoje.

Citokinai

Citokinai– tai didelė grupė baltyminės kilmės tarpląstelinės sąveikos mediatorių, dalyvaujančių hemopoezėje, imuninėse ir uždegiminėse reakcijose, daugelyje kitų biologinių procesų. Citokinų signalą gavusi ląstelė gali proliferuoti, diferencijuotis, sekretuoti kitus citokinus, migruoti, būti slopinama arba žūti. Citokinai – tai nedidelės molekulinės masės baltymai, kurių pagrindinis šaltinis yra monocitai/makrofagai ir limfocitai. Dabar žinoma daugiau kaip 100 struktūriškai ir genetiškai skirtingų citokinų. Jie suskirstyti į šeimas pagal pirminį biologinį poveikį: interleukinai, interferonai, kolonijas stimuliuojantys faktoriai, chemokinai, augimo faktoriai ir naviko nekrozės faktoriai. Pažeidus audinius, prasidėjus uždegimui ir imuniniam atsakui, hemopoezinius citokinus pradeda gaminti ir aktyvinti T limfocitai helperiai ir aktyvinti makrofagai.

Citokinų vaidmuo vėžio ląstelėse

Šiuo metu vis daugiau dėmesio susilaukia citokinų dalyvavimas piktybinių auglių susidaryme. Čia pagrindinį vaidmenį atlieka du citokinai: IL-2 ir IL-21. Šie citokinai turi priešingą veikimą. IL-2 skatina citotoksinių T limfocitų, T reguliacinių ląstelių (Treg) brendimą ir padeda aktyvuoti T ląsteles, kurios geba lizuoti navikines ląsteles. Tuo tarpu IL-21 slopina šį procesą. Toks antagonistinis interleukinų veikimas gali būti naudojamas imunoterapijoje prieš vėžį ir kitus imuninius sutrikimus. Kitas uždegiminėse reakcijose dalyvaujantis citokinas TNF-α yra uždegiminis citokinas. Onkogeninis jo efektyvumas yra matomas šio citokino gebėjime skatinti ląstelių proliferaciją krūtų vėžio ir inkstų ląstelių karcinomos atveju.

NKκB transkripcijos faktorius ir jo signalinis kelias

Branduolio faktorius – κB (NF-κB) reguliuoja daugybės genų, atsakingų už imuninę reakciją, ląstelės adheziją, diferenciaciją, proliferaciją, angiogenezę ir apoptozę, transkripciją. Nukrypimai nuo normos šio faktoriaus reguliaciniame mechanizme susiję su daugybe žmogaus organizmo patologijų, tokių kaip uždegiminių procesų sukeltos ligos, imuninis deficitas, diabetas, aterosklerozė bei vėžiniai susirgimai. Dažniausiai pasitaikančios chroninės uždegiminės ligos, susijusios su šiuo faktoriumi, yra reumatoidinis artritas, psoriazinis artritas, opinis kolitas ir Krono liga. Daugelis citokinų aktyvuoja NFκB transkripcijos faktorių. Didžiausi šio aktyvuoto faktoriaus subvienetai – p50 ir p65. NFκB aktyvuojamas, kuomet inhibitorius kappaB (IκB) fosforilinamas IκB kinazės (IKK). Padidėjusi NFκB aktyvacija pasireiškia uždegiminiame procese. Buvo nustayta, jog NFκB lygis padidėja esant žarnyno uždegimui, tokiam kaip opinis kolitas ar Krono liga. Taip pat NFκB aktyvaciją žarnyno uždegimo atveju paskatina ir citokinai: IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, IL-12 ir TNF-α, kuris atlieka pagrindinę rolę šiame procese.

NFκB signalinis kelias svarbus navikų formavimesi ir nustatant vėžio agresyvumo lygį. Jis sustiprina navikų angiogenezę, proliferaciją, antiapoptotinę reakciją ir slopina imuninį atsaką. NFκB sukuria ryšį tarp uždegiminių reakcijų ir vėžinių susirgimų. Būtent todėl šiuo metu dėmesio centre yra NFκB veikimas kaulų čiulpų kamieninėse ląstelėse. NFκB reguliuoja augimo faktorių ir citokinų sekreciją suaugusiose ir naujagimių kaulų čiulpų kamieninėse ląstelėse. Kraujagyslių endotelinio augimo faktoriaus kiekis sumažėja nuo IKK inhibicijos suaugusių kamieninėse ląstelėse. Šis įvykis yra pilnai revertuojamas TNF-α pagalba. Taip pat IL-6 kiekis sumažėja nuo NFκB inhibicijos tiek suaugusių, tiek naujagimių kamieninėse ląstelėse. Šie rezultatai parodo, jog NFκB yra pagrindas kamieninių ląstelių veikimo procese, produkuojant kraujagyslių endotelinį augimo faktorių. Paskutiniais literatūriniais duomenimis nustatyta NFκB svarba piktybinių navikų formavimosi procese. Piktybinių keratinocitų formavimosi atveju TNF-α signalinis veikimas priklauso nuo NFκB faktoriaus.

Ieškant efektyviausių būdų gudant onkologines ligas, NF-κB faktoriaus veikimas yra labai svarbus. Transformuotas augimo faktorius β (TGF- β) pašalina NF-κB signalinį kelią. Taip pat TAK1/MEK signalinis kelias skatina NF-κB antiapoptotinį efektą. Todėl šie faktoriai ir signaliniai keliai ateityje gali būti panaudoti gydant NF-κB sukeliamas ligas ir jų prevencijoje.

Pastaraisiais metais pasaulio mokslininkai labai aktyviai tyrinėja žmogaus kamienines ląsteles, tikėdamiesi šių tyrimų pagrindu sukurti naujus būdus gydymui sunkių ligų, tokių kaip Alzheimerio liga, Parkinsono liga, nugaros smegenų pažeidimai, išsėtinė sklerozė, diabetas, miokardo infarktas. Tiriant kamieninių ląstelių priešuždegiminį poveikį nustatyta, kad fetalinių kepenų homogenato ląstelės bei fetalinių kepenų hemopoetinės kamieninės ląstelės kontaktinio hiperjautrumo reakcijos modelyje in vivo slopina edemą.

Pirmos ląstelės, panaudotos klinikiniuose tyrimuose pakeičiant kardiomiocitus, buvo raumens mioblastai. Šie darbai suteikė daug optimizmo, tačiau vėliau buvo parodyta, kad paprastas kamieninių ląstelių perkėlimas į širdį, net naudojant humoralinį stimuliavimą, teigiamo poveikio širdies reparacijoje neduoda. Tiriant kamieninių ląstelių įtaką neovaskuliarizacijai, buvo parodyta, kad ląstelių terapijos galimybės dėl nepakankamo transplantuotų ląstelių gyvybingumo laipsnio yra ribotos bei priklauso nuo recipiento amžiaus ir jo sveikatos būklės.

Pastaruoju metu mokslinėje literatūroje paskelbta daug su kamieninių ląstelių panaudojimu susijusių hipotezių, kurias dar reikia įrodyti. Kamieninių ląstelių naudojimas gydymo tikslais yra techniškai įmanomas, perspektyvus ir pažangus metodas, tačiau norint jas efektyviai taikyti medicinoje dar būtina atlikti daug išsamių tyrimų.

Vakcinos

Vakcinos (Dendritinės ląstelės)

Dendritinės ląstelės (DL) yra įgimto imuninio atsako ląstelės, kurios dalyvauja žinduolių imuninės sistemos procesuose. Pagrindinė DL funkcija – antigeno pristatymas, t. y. antigeno apdorojimas ir jo pateikimas ant ląstelės paviršiaus su kitomis imuninę sistemą formuojančiomis ląstelėmis. DC geba greitai aktyvuoti antigenui specifiškas T-ląsteles, kurios gali pašalinti ne tik patogenų pažeistas, tačiau ir navikines ląsteles. Būtent dėl šios priežasties DL gali būti naudojamos kuriant vakcinas prieš įvairaus tipo vėžines ląsteles.

Iškart po pirmųjų antigeno signalų prasideda DL brendimas. Tai daugiapakopis, laikinai valdomas procesas, kuris apima keletą fenotipinių ir morfologinių pokyčių, tokių kaip: sumažėjusi fagocitozė, pakitusi chemokino receptorių raiška. Subrendusios DL aktyviai migruoja iš periferijos į limfinius mazgus, čia DL pristato fagocituojamus antigenus.

Nors pakantumas daugeliui antigenų yra nustatomas vykstant limfocitų brendimui, tačiau dalis navikų gali ekspresuoti netipiškus antigenus, kurie išskiriami tik vaisiuje. Kiti navikai geba išskirti mutavusius antigenus, tokius kaip p53 ar naujus baltymus, kurie susiformavo dėl chromosomų persitvarkymo. Tokie antigenų pakitimai palengvina naviko plitimą organizme, kadangi su augliu susiję antigenai sumažina imuninės sistemos atsaką. Dažniausiai tokie navikai naudoja platų spektrą įvairių mechanizmų, kurie blokuoja T-ląsteles. Daugelis jų sekretuoja tirpius inhibitorinius faktorius: IL-10, VEG-F, TGF-β, kurie tiesiogiai ir netiesiogiai inhibuoja T-limfocitų veikimą inhibuojant DL brendimą. Navikai, kurie neekspresuoja pavojaus signalų, gali nesukelti įgimtos imuninės sistemos atsako, dėl ko naviko antigenui specifiškos T-ląstelės gali likti ramybės būsenoje. Vakcinos, kaip ir monokloniniai antikūnai, yra priskiriamos prie specifinės imunoterapijos. Pagrindinis tikslas, kuriant DL vakcinas yra aktivuoti naivias T ląsteles ar sumažinti naviko išskiriamų antigenų specifiškumą. Tam tikslui kuriami stimulai (kostimuliacinių molekulių įterpimas į navikines vakcinas), kurie sukelia Th1 imuninį atsaką, kurį atpažįsta antigenui specifiniai helperiniai ir citotoksiniai T-limfocitai, dėl ko navikas yra pašalinamas. Tokių kostimuliacinių molekulių perkėlimas į vėžines ląsteles aktyvina T-limfocitus be tarpinių ląstelių ir leidžia tiesiogiai stimuliuoti imuninį atsaką. Tačiau daugelis navikų turi slopinamąjį pobūdį, dėl kurio aktyvuotas vakcinos pagalba T-ląsteles reikėtų iš naujo aktyvinti, kadangi vieną kartą vakcina paveiktas T-ląsteles naviko antigenai galėtų neutralizuoti .

Ikiklinikiniai ir klinikiniai tyrimai parodė, kad DL vakcina turėtų turėti 3 pagrindines savybes: būti išlaikiusi gebėjimą migruoti į limfinius mazgus (geriausia aplinka T-limfocitų aktyvinimui); ilgaamžiškumas (DL privalo pakankamai laiko išlaikyti savo subrendusios ląstelės fenotipą limfiniuose mazguose, kad T-limfocitai sugebėtų atpažinti ir pašalinti naviką); DL turi stabiliai gaminti TAA, kurį sugebėtų atpažinti specifiški TAA T-limfocitai.

Apibendrinant galima teigti, kad DL vakcina – tai pakeistos dendritinės ląstelės, kuriose yra su norimu augliu susijęs antigenas. DL vakcinos esmė – po jos įvedimo pacientui, norima, kad ji sukeltų imuninį T-limfocitų atsaką tiesiogiai į naviką, nepaveikiant kitų sveikų ląstelių. Manoma, kad DL vakcinos geriausiai veiktų, jei su antigenu sąveikautų ir būtų aktyvinamos paties paciento dendritinės ląstelės.

Literatūra:

[1] Altshuler, E.P., Serebryanaya, D.V., Katrukha, A.G., (2010) Generation of recombinant antibodies and means for increasing their affinity. Biochemistry 75(13):1854-1605.
[2] Dhawan, Sangeeta; Senta, Georgia; and Anil, Bhushan. (2007) Formation and Regeneration of the Endocrine Pancreas. Current Opinion in Cell Biology 200719 (6) (December): 634–645. doi:10.1016/j.ceb.
[3] Duncan, W. A., Dorrell, A., Grompe, M. (2009) Stem cells and liver regeneration. Gastroenterology: 466-481.
[4] Hashimoto, D., Miller, J. & Merad, M. (2011).Dendritic cell and macrophage heterogeneity in vivo. Immunity35: 323–335 .
[5] Howard G.C., Matthew R. Kase M.R. (2006). Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. CRC Press: 408.
[6] Little, (2009) Recombinant Antibodies for Immunotherapy. Cambridge University Press: 419.
[7] Sueblinvong, V. ir Weiss, D.J. (2010) Stem Cells and Cell Therapy Approaches in Lung Biology ans Diseases. Transplantational Research 15(3):188-205.

 

 

 

Lecturer