Molekulinio ir ląstelinio imuniteto tyrimai biologiniuose modeliuose in vitro ir in vivo

Free Register

Remiantis kloninės selekcijos teorija žinoma, jog kiekviename gyvame organizme yra tik keletas svarbiausių imuninės sistemos ląstelių – T ir B limfocitų, specifinių vienam konkrečiam antigenui. Todėl jų funkcijų tyrimas po antigeninės stimuliacijos gyvame organizme yra techniškai sunkiai įvykdomas. Pagrindinės mūsų žinios apie ląstelinius ir molekulinius procesus, vykstančius organizme po antigeno patekimo, gautos iš modelinių sistemų, naudojamų tyrimuose tiek in vitro, tiek in vivo.

T ir B ląstelių funkcijos organizme labai skiriasi, kaip ir jų aktyvavimas ir tam naudojamos medžiagos bei tyrimo metodai, todėl juos aptarsime atskirai.

T limfocitų atsako tyrimo metodai

In vitro eksperimentuose gauta labai daug informacijos apie pasikeitimus, vykstančius T ląstelėse po jų aktyvavimo antigenais. Neseniai sukurti ir keli in vivo T limfocitų proliferacijos, citokinų ekspresijos ir anatominio pasiskirstymo po atsako į antigeną tyrimo metodai. Naujos eksperimentinės tyrimų schemos ypač naudingos tiriant naivių T ląstelių aktyvavimą ir antigenui specifinių atminties T ląstelių lokalizaciją po imuninio atsako sumažėjimo. Toliau detaliau aptarsime pagrindinius ir dažniausiai naudojamus T ląstelių aktyvavimo ir jų funkcijų tyrimo metodus.

Polikloninė T ląstelių aktyvacija. Organizme T ląsteles daugiausia aktyvuoja antigenus pateikiančios ląstelės (APC): dendritinės, B ląstelės ir makrofagai, – dar vadinamos profesionaliomis APC. Jos antigeninius peptidus ekspresuoja ant savo membranose esančių MHC II klasės molekulių. Šiuos peptidų-MHC kompleksus atpažįsta T ląstelių receptoriai (TCR). In vitro eksperimentuose naudojami polikloniniai T ląstelių aktyvatoriai, kurie rišasi prie visų ar beveik visų TCR, nepaisant jų specifiškumo, ir aktyvuoja T ląsteles panašiai kaip MHC-peptidų kompleksai ant APC ląstelių. Tokie polikloniniai stimuliatoriai dažnai yra naudojami stimuliuoti iš žmogaus kraujo ar iš eksperimentinių gyvūnų limfinių audinių išskirtas T ląsteles, kadangi jie sukelia imuninį atsaką mišriose T limfocitų populiacijose su nežinomu antigeniniu specifiškumu, ir net naivių T ląstelių populiacijose. Patys populiariausi T ląstelių polikloniniai aktyvatoriai yra augaliniai lektinai, konkanavalinas A ir fitohemagliutininas, kurie specifiškai rišasi prie T ląstelių paviršiaus glikoproteinų cukrų liekanų, tarp jų ir prie TCR bei CD3 baltymų, ir tokiu būdu stimuliuoja T ląsteles. Kaip polikloniniai T ląstelių aktyvatoriai yra naudojami ir antikūnai, specifiški TCR ar CD3 baltymų pastovių struktūrų epitopams. Optimaliam aktyvacijos atsakui gauti dažnai šie antikūnai imobilizuojami ant kietų paviršių ar rutuliukų arba kryžmiškai surišami su antriniais antikūnais, specifiniais pirminiams antikūnams. Kadangi tirpūs polikloniniai aktyvatoriai nepateikia kostimuliatorinių signalų, natūraliai pateikiamų APC ląstelėmis, kartu su jais dažnai naudojami stimuliuojantys antikūnai, specifiniai kostimuliatorių receptoriams, t. y. anti-CD28 arba anti-CD2. Dar kita polikloninių stimuliatorių grupė yra superantigenai, kurie rišasi ir aktyvuoja visas T ląsteles, ekspresuojančias TCR β grandinę. Bet kokio antigeninio specifiškumo T ląsteles gali aktyvuoti ir farmakologiniai reagentai, tokie kaip forbolo esteris PMA kartu su kalcio jonoforu jonomicinu.

Polikloninių T ląstelių populiacijų aktyvinimas antigenu

Kraujo ir periferinių limfinių organų normalių T ląstelių polikloninę populiaciją, praturtintą vienam antigenui specifinėmis T ląstelėmis, galima gauti imunizuojant individą norimu antigenu. Imunizacija padidina antigenui specifinių T ląstelių, kurios in vitro gali būti pakartotinai stimuliuojamos tuo pačiu antigenu kartu įdėjus su T ląstelėmis pagal MHC-suderintų APC, kiekį. Šis metodas naudojamas jau aktyvuotų („įjautrintų“) mišrių T ląstelių populiacijų, ekspresuojančių daug skirtingų TCR, antigenu sukeltos aktyvacijos tyrimams, tačiau jis netinka naivių T ląstelių aktyvacijos atsako tyrimui.

Specifinių vienam antigenui T ląstelių populiacijų aktyvinimas

 Monokloninės T ląstelių, ekspresuojančių identiškus TCRs, populiacijos naudojamos ląstelių funkcijų, biochemijos ir molekuliniams tyrimams. Šių monokloninių populiacijų trūkumas yra tai, jog jos yra ilgalaikės audinių kultūrų linijos ir gali fenotipiškai skirtis nuo normalių T ląstelių in vivo. Viena iš dažniausiai imunologijoje naudojamų tokių populiacijų yra antigenui specifiniai T ląstelių klonai. Tokie klonai gaunami išskiriant T ląsteles iš imunizuotų individų, kaip jau aprašyta aukščiau polikloninėse T ląstelėse. Pakartotinai stimuliuojant tokias ląsteles in vitro su imunizacijai naudotu antigenu, kartu įdedant pagal MHC-suderintas APC, ir atliekant toliau klonavimą iki vienos ląstelės, atsakančios į antigeną, pusiau kietoje terpėje ar skystoje terpėje, gaunamos monokloninės konkrečiam antigenui specifinės T ląstelių monokloninės populiacijos. Šiose populiacijose labai lengva įvertinti antigenui specifinį atsaką, nes visos ląstelės klonuotoje linijoje turi tuos pačius receptorius. Sukurti tiek helperių, tiek ir citotoksinių T limfocitų klonai, išskirti iš pelių ir žmogaus. Kitos monokloninės T limfocitų populiacijos, naudojamos T ląstelių aktyvinimo tyrimuose, yra antigenui specifinės T ląstelių hibridomos, kurios gaunamos taip pat kaip ir B ląstelių hibridomos (žr. 1 pav.). 

1

1 pav. Monokloninių antikūnų gamybos schema. T hibridomos gaunamos penktame etape jas padauginus ląstelių kultūrose.

Plačiai naudojamos ir vėžinių ląstelių linijos, sukurtos iš gyvūnų ir žmonių, sergančių T ląstelių leukemijomis ir limfomomis, vėžinių T ląstelių. Nors kai kurios vėžinės linijos ekspresuoja funkcionuojančius TCR kompleksus, jų antigeninis specifiškumas dažniausiai nežinomas ir eksperimentuose tokių linijų ląstelės stimuliuojamos polikloniniais aktyvatoriais. Viena iš populiariausių T ląstelių linijų, Jurkat linija, gauta iš žmogaus leukeminių T ląstelių, yra tokių vėžinių linijų pavyzdys. 

TCR transgeninės pelės

Modeliu T ląstelių signalų perdavimui in vitro ir in vivo eksperimentuose plačiai naudojamos TCR transgeninės pelės. Tai homologinių, identiško specifiškumo, fenotipiškai normalių T ląstelių šaltinis. Jeigu žinomo specifiškumo vieno TCR persitvarkę α ir β grandinių genai yra ekspresuojami kaip transgenai pelėse, dauguma jų subrendusių T ląstelių ekspresuos šį TCR. Jeigu TCR transgenas yra ekspresuojamas pelėse, neturinčiose baltymo RAG-1 ar RAG-2 (DNR rekombinaziniai baltymai, dalyvaujantys Ig ir TCR susiformavime), visos T ląstelės ekspresuos tik transgeninius TCR. Tokias TCR transgeninės T ląsteles galima aktyvuoti in vitro ir in vivo vienu peptidiniu antigenu ir identifikuoti specifiniais transgeniniam TCR antikūnais. Vienas iš unikalių TCR transgeninių pelių pranašumų yra tai, kad iš jų galima išskirti pakankamą kiekį žinomo specifiškumo naivių T ląstelių ir tirti funkcinį atsaką į pirmą susitikimą su antigenu. Šis pranašumas leidžia mokslininkams nustatyti in vitro sąlygas, kuriomis naivios T ląstelės po aktyvinimo antigenu pradeda diferencijuotis į funkcines subpopuliacijas, tokias kaip TH1 ir TH2 ląsteles. Iš TCR transgeninių pelių išskirtos naivios T ląstelės taip pat gali būti suleistos į normalias singenines recipientines peles, kuriose jos keliauja į limfinius audinius. Recipientinės pelės paprastai toliau imunizuojamos specifiniu antigenu ir TCR transgenines T ląsteles pažymėjus antikūnais galima stebėti jų dauginimąsi ir diferenciaciją in vivo. Vėl ląsteles išskyrus iš pelių, galima tirti antrinį atsaką į antigeną ex vivo.

T ląstelių identifikavimo ir funkcinio atsako tyrimo metodai

Proliferacijos tyrimai

Kaip ir kitų ląstelių, T limfocitų proliferacijos tyrimai in vitro atliekami nustatant 3H-žymėto timidino įsijungimą į auginamų ląstelių besireplikuojančią DNR. Timidino įjungimas leidžia kiekybiškai išmatuoti DNR sintezės greitį, kuris tiesiogiai proporcingas ląstelių dalijimosi greičiui. Ląstelių proliferacija in vivo matuojama suleidžiant gyvūnams timidino analogą bromodezoksiuridiną (BrdU) ir dažanT ląsteles su anti-BrdU antikūnais. Taip identifikuojami ir kiekybiškai įvertinami ląstelių branduoliai, įjungę BrdU į savo besireplikuojančią DNR. Kitas T ląstelių proliferacijos tyrimas in vivo gali būti atliekamas su fluorescuojančiais dažais. Pirmiausia T ląstelės in vitro pažymimos chemiškai reaktyviu lipofiliniu fluorescuojančiu esteriu, tada perkeliamos į eksperimentinius gyvūnus. Dažai įeina į ląsteles ir, prisijungę prie citoplazminių baltymų, lieka jose. Dažniausiai naudojamas šio tipo dažas yra 5,6-karboksifluoresceino diacetato sukcinimidilo esteris (CFSE), kurį ląstelėse galima nustatyti standartine tėkmės citometrijos technika (apie šį metodą skaityti toliau). Kiekvieną kartą pasidalinus T ląstelei, jos dažų kiekis sumažėja perpus. Taip galima nustatyti, ar perkeltos T ląstelės recipientinių pelių limfiniuose audiniuose pasidalijo ir kiek kartų pasidalijo.

Peptidų-MHC tetramerai

Peptidų-MHC tetramerai yra naudojami identifikuoti T ląsteles, specifines vienam antigenui. Ląstelės paprastai išskiriamos iš eksperimentinių gyvūnų ir žmogaus kraujo ar limfinių audinių. Šiuos tetramerus sudaro 4 peptidų-MHC kompleksai, kuriuos T ląstelės normaliai atpažįsta ant APC ląstelių paviršiaus. Tetramerai konstruojami iš I klasės MHC molekulių taikant rekombinantinės DNR technologiją. Prie kiekvieno peptido-MHC komplekso pririšamas biotinas. Įdėjus avidino, galinčio sujungti 4 biotino molekules, suformuojami tetramerai. MHC molekulė pakraunama norimu peptidu, kuris galutinai stabilizuoja kompleksą. Avidinas paprastai pažymimas fluorochromu (2 pav.).

2

2 pav. Tetramero konstrukcija ir dažai. (A) Tirpi I klasės MHC sunki grandinė susintetinama E. coli bakterijose. (B) Sunki grandinė papildoma lengva grandine (β2-mikroglobulinu), specifiniu peptidu ir biotilinama MHC molekulės C gale. (C) Tetrameras sukonstruojamas iš 4 MHC-biotino kompleksų, sujungiant juos per streptavidino molekulę. Streptavidinas yra konjuguotas su fluorochromu (PE – fikoeritrinas), kuris leidžia šį tetramerą tirti tėkmės citometrija. (D) Tetrameras sumaišomas su tiriama ląstelių populiacija. Tetramerai prisiriš prie CD8+ T ląstelių, ekspresuojančių specifinius peptidui TCR. Įdėjus monokloninių antikūnų, pažymėtų kitu fluorochromu (APC – alofikocianinas), identifikuojama ląstelių populiacija.

Šis metodas yra vienintelis būdas identifikuoti antigenui specifines žmonių T ląsteles. Pvz., galima identifikuoti ir įvertinti cirkuliuojančias HLA-A2-apribotas T ląsteles, specifines ŽIV peptidui, dažant kraujo ląsteles su HLA-A2 molekulių tetramerais, pakrautais peptidu. Ta pati technika naudojama identifikuoti ir išskirti T ląsteles, specifines saviems antigenams normaliuose individuose ir autoimuninėmis ligomis sergančiuose pacientuose. Ši technika daug sunkiau pritaikoma II klasės MHC molekulėms, nes abi grandinės šiame komplekse yra polimorfinės (I klasės MHC komplekse polimorfinė tik viena grandinė) ir būtinas teisingas šių grandinių surinkimas. Tačiau šiuo metu jau gaminami ir II klasės MHC-peptidų tetramerai.

Citokinų sekrecijos tyrimai

Šie metodai naudojami kiekybiškai įvertinti citokinus sekretuojančias efektorines T ląsteles limfiniuose audiniuose. Dažniausiai naudojami metodai yra citoplazminių citokinų dažymas (ICC; angl. intracellular cytokine cytometry) ir atskiros ląstelės fermentinis tyrimas (ELISpot; angl. enzyme-linked immunospot). Šiuose tyrimuose antigeno sukelta T ląstelių aktyvacija ir diferenciacija vyksta in vivo. Po to T ląstelės išskiriamos ir testuojama citokinų ekspresija in vitro. Citoplazminis citokinų dažymas atliekamas permeabilizuojanT ląstelių membranas (padidinant jų pralaidumą), kad į ląsteles galėtų patekti fluorochromu pažymėti tam tikram citokinui specifiniai antikūnai. Nudažytos ląstelės tiriamos tėkmės citometrija. Citokinų ekspresija specifinėse tam tikram antigenui T ląstelėse nustatoma papildomai nudažant T ląsteles su peptido-MHC tetramerais arba, turint TCR transgenines T ląsteles, su specifiniais transgeniniam TCR antikūnais. Naudojant kartu CFSE ir citokinams specifinius antikūnus galima tirti ryšius tarp ląstelių proliferacijos ir citokinų ekspresijos. ELISpot tyrime šviežiai išskirtos iš kraujo ar limfinių audinių T ląstelės yra inkubuojamos plastikinės plokštelės duobutėse, padengtose tam tikram citokinui specifiniais antikūnais. Šie antikūnai suriša atskirų T ląstelių sekretuojamus citokinus ir sekretuojančios ląstelės lokalizacijos vietoje susidaro dėmelė, kuri išryškinama įdėjus antrinius su fermentu konjuguotus anti-IG antikūnus. Kiekybiškai įvertinus susidariusias dėmes, nustatomas citokinus sekretuojančių T ląstelių skaičius (3 pav.).

3

3 pav. ELISpot metodo schema ir rezultatų įvertinimas. 1. Specialių plokštelių šulinėliai padengiami citokinui specifiniais antikūnais arba antigenais. Į šulinėlius įdedamos ląstelės kartu su stimuliatoriais arba be jų. Sekretuojami citokinai arba Ig surišami pirminių sugaudančių pririštų molekulių. 2. Ląstelės atplaunamos, o surišti citokinai arba Ig nustatomi antriniais antikūnais, žymėtais biotinu. 3. Įdedamas streptavidinas, žymėtas fermentu ir substratas fermentui. 4. Streptavidinas kovalentiškai rišasi prie biotino. Dėmės įvertinamos mikroskopu arba ELISpot skaitytuvu. Kiekviena dėmė – sekretavusi ląstelė. Kuo didesnė dėmė, tuo daugiau sekretavo citokinų ar Ig.

ELISpot tyrimas gali būti atliekamas ir in vitro ląsteles stimuliuojant plokštelės duobutėse. ICC metodas turi pranašumą prieš ELISpot, nes šiuo metodu citokinus produkuojanti antigenui specifinė ląstelė gali būti įvertinta kartu ir fenotipiškai.

B limfocitų atsako tyrimo metodai

Polikloninių B limfocitų populiacijų aktyvinimas

Techniškai sunku tirti antigenų poveikį normalioms B ląstelėms, kadangi, kaip ir T ląstelių, individe yra labai nedaug specifinių vienam antigenui B ląstelių. Buvo iškelta prielaida, jog imunoglobulinams specifiniai antikūnai gali veikti kaip antigenai, t. y. rištis prie B ląstelių membraninių Ig molekulių pastovios (C) srities ir turėti tą patį biologinį poveikį kaip antigenai, kurie rišasi prie membraninių Ig molekulių hipervariabilios srities, bet tik ant antigenui specifinių B ląstelių. Ši prielaida pasirodė teisinga ir dabar anti-Ig antikūnai dažnai naudojami kaip polikloniniai B ląstelių aktyvatoriai, panašiai kaip anti-CD3 antikūnai, naudojami kaip polikloniniai T limfocitų aktyvatoriai.

Specifinių vienam antigenui B ląstelių populiacijų aktyvinimas antigenu

Tam, kad būtų galima tirti antigeno rišimosi prie B ląstelių poveikį, mokslininkai turėjo išskirti antigenui specifines B ląsteles iš viso mišinio normalių limfocitų populiacijų arba pagaminti klonuotas B ląstelių linijas su apibrėžtu antigeniniu specifiškumu. Visos pastangos tai padaryti nedavė praktiškai pastebimų rezultatų, kol nebuvo sukurtos transgeninės pelės, kuriose beveik visos B ląstelės ekspresavo žinomo specifiškumo transgeninius Ig. Kitaip tariant, dauguma šių pelių B ląstelių reagavo į tą patį antigeną. Vėliau buvo sukurtas dar sudėtingesnis modelis: antigeniniais receptoriais „knockin“ pelių persitvarkę Ig H ir L grandinių genai buvo homologiškai rekombinuoti į jų endogeninius lokusus. Tokie „knockin“ gyvūnai ypač pasitarnavo tiriant receptorių redagavimą. Transgeninių gyvūnų kūrimas detaliau aptartas kitame skyriuje.

B ląstelių proliferacijos ir antikūnų sintezės tyrimo metodai

Dauguma mūsų žinių apie B ląstelių aktyvavimą buvo gauta iš eksperimentų in vitro, kuriuose, panašiai kaip ir su T ląstelėmis, buvo naudojami įvairūs stimuliatoriai ir tiksliai įvertinama proliferacija ir diferenciacija. Tą patį galima atlikti ir su imunizuotų individų B ląstelėmis arba su homogeninėmis B ląstelėmis, ekspresuojančiomis transgenų koduojamus receptorius antigenams. B ląstelių proliferacija matuojama pažymint CFSE arba 3H-timidinu in vitro, o in vivo – BrdU, kaip aprašyta T ląstelių proliferacijos tyrimuose. Antikūnų sintezė B ląstelėse dažniausiai matuojama dviem metodais: susikaupę ląstelių kultūrų supernatantuose, serumuose ir kituose organizmo skysčiuose imunoglobulinai matuojami ELISA metodu (žiūrėti žemiau), o atskirų ląstelių sintezuojami Ig matuojami jau aprašytu ELISpot metodu. Kiti metodai, kuriais matuojamas antikūnų lygis, yra hemagliutinacija (eritrocitams specifinių antikūnų įvertinimas) ir komplemento sukelta lizė (žinomam ląstelių tipui specifinių antikūnų įvertinimas). Pastaraisiais metodais paprastai atitinkamai nustatomas antikūnų titras, reikalingas agliutinuoti arba lizuoti žinomą ląstelių kiekį.

Dauguma molekulinio ir ląstelinio imuniteto mokslinių ir klinikinių rutininių tyrimų atliekami naudojant antikūnus. Be to, daugelio modernios molekulinės biologijos metodų panaudojimas suteikia labai svarbios informacijos apie imuninę sistemą. Be šių metodų būtų neįmanomi jokie imuniteto tyrimai. Todėl pirmiausia trumpai aptarsime dažniausiai imunologijoje naudojamus laboratorinius metodus, taip pat jų panaudojimą T ir B limfocitų atsako tyrimui.

Antikūnus naudojantys laboratoriniai metodai

Didžiulis antikūnų specifiškumas antigenui naudojamas šių antikūnų nustatymui, išgryninimui ir kiekybiniam įvertinimui. Antikūnai gali būti gaminami prieš bet kokias makromolekules ir mažas chemines medžiagas, todėl jų panaudojimas yra labai platus tiek in vitro, tiek in vivo įvairių molekulių tyrimui. Sukūrus monokloninių antikūnų gamybos metodą, jų panaudojimas dar labiau išsiplėtė. Monokloniniai antikūnai gali būti gaunami bet kokio norimo specifiškumo, be jų neįmanomi jokie tyrimai imunologijoje. Antikūnų panaudojimas remiasi jų specifine sąveika su antigenu. Šios sąveikos metu susidarantys dideli imuniniai kompleksai gali būti nustatomi įvairiais metodais. 

Kiekybinis antigenų įvertinimas

Patys populiariausi molekulinio imuniteto tyrimai, kai reikia kiekybiškai įvertinti imuniniame atsake dalyvaujančias molekules, yra radioimuninis (RIA, angl. radioimmunoassay) ir imunofermentinis (ELISA, angl. enzime-linked immunosorbent assay) tyrimai. Tai labai jautrūs ir specifiniai metodai, jau tapę standartiniais metodais tiek moksliniuose, tiek klinikiniuose imuniteto tyrimuose in vitro. Šių imunocheminių metodų esmė yra tai, jog turint gryną antigeną arba antikūną, jų kiekį galima išmatuoti panaudojus žymę, t. y. radioizotopą (RIA metodas) arba fermentą (ELISA metodas). Sukurta eilė RIA ir ELISA metodų variantų, bet populiariausias yra daugiasluoksnis RIA ar ELISA metodas (angl. sandwich). Šiame metode naudojami du skirtingi antikūnai, atpažįstantys nepersidengiančius skirtingus to paties antigeno epitopus, kurio koncentraciją reikia išmatuoti. Fiksuotas pirmų antikūnų kiekis pririšamas prie tvirto paviršiaus, dažniausiai plastikinės mikrotitravimo plokštelės šulinėlių. Tada į šulinėlius dedamas tiriamas tirpalas su nežinoma antigeno koncentracija, šalia ištitravus standartinį tirpalą su žinoma antigeno koncentracija. Antigenas rišasi prie šulinėlio dugne esančių antikūnų, neprisirišę antigenai atplaunami. Į šulinėlius dedami antri antikūnai, žymėti radioizotopu arba fermentu, ir kuo daugiau šulinėliuose bus prie pirminių antikūnų prisirišusių antigenų, tuo daugiau prie šių antigenų prisiriš antrinių žymėtų antikūnų. Pagal standartinių antigenų rišimąsi nubraižomos standartinės kreivės, iš kurių išskaičiuojamos tiriamų tirpalų antigenų koncentracijos. Radioizotopas matuojamas specialiu izotopų matavimo skaitliuku, o fermentas matuojamas spektrofotometru pagal spalvoto produkto susidarymą po jo reakcijos su substratu. Taip gali būti nustatomi ir specifiniai patogenams antikūnai organizmo skysčiuose ir ląstelių kultūrose arba tiesiogiai prie tvirto paviršiaus pririšant patogenų antigenus arba netiesiogiai atliekant daugiasluoksnį imunocheminį tyrimą. Bendra imunocheminių tyrimų schema nubraižyta 4pav.

4

4 pav. Daugiasluoksnio imunofermentinio arba radioimuninio tyrimo schema.

Antigenų charakterizavimas ir gryninimas

Antikūnai plačiai naudojami baltymams (antigenams) identifikuoti, charakterizuoti ir išgryninti iš mišinių. Tam dažniausiai taikomi imunoprecipitacijos ir imunoafininės chromatografijos metodai. Biologiniuose mėginiuose antigeno buvimui ir jo dydžiui nustatyti labai plačiai naudojamas Western bloto (imunobloto) metodas. Antikūnai paprastai naudojami antigenams iš detergentinio ląstelių lizato išskirti. Antigenų išskyrimo metodai nuolat tobulinami siekiant gauti efektyvesnį antigenų išskyrimą, pvz., pastaruoju metu į antigenų tirpalą dedami nesurišti antikūnai ir prie agarozės dalelių pririšti stafilokokiniai baltymai A arba G. Antikūnų Fab dalis rišasi prie specifinių antigenų, o Fc dalis – prie baltymo A arba G, surišto su agaroze. Taip gaunami antigenų-antikūnų kompleksai, kuriuos lengva išskirti ir detergentais, keičiant pH ar druskų koncentracijas eliuuoti iš šių kompleksų laisvus antigenus (5 pav.).

5

5 pav. Antigenų išskyrimas imunoprecipitacija arba afinine chromatografija. Abiejų metodų principas tas pats, tik afininėje chromatografijoje prie rutuliukų pririšti antikūnai yra supilami į kolonėlę. Šie metodai gali būti naudojami tiek antikūnams, tiek antigenui išvalyti.

Eliuuoti baltymai toliau gali būti charakterizuojami poliakrilamidiniame (SDS-PAGE) gelyje dažant baltyminiais dažais arba atliekant imunoblotą su specifiniais antikūnais.

Imunoblotas (Western blotas)

Imunoblotas naudojamas identifikuoti ir nustatyti santykinį kiekį ir molekulinę masę baltymo, esančio baltymų mišinyje. Mišinys pirmiausia analitiškai išskirstomas paprastai SDS-PAGE ir nustatoma įvairių baltymų padėtis gelyje yra jų molekulinės masės funkcija. Toliau elektroforetiškai išskirstyti baltymai perkeliami ant membranos ir jų padėtis nustatoma surišant su specifiniais jiems nežymėtais antikūnais. Įdėjus antrinių, žymėtų antikūnų, specifinių pirminiams antikūnams, nustatomas antigenų dydis ir kiekis (6 pav.).

6-16-2

6 pav. Antigenų tyrimas Western blotu. Baltyminiai antigenai, išskirstyti natrio dodecil sulfato (SDS) poliakrilamidinio gelio (PAGE) elektroforezėje ir perkelti ant membranos, gali būti nustatomi antikūnais. 

Bendrai, antriniai antikūnai paprastai būna pažymėti fermentais, kurie skleidžia chemiliuminescencinius signalus, paliekančius atvaizdą ant fotografinės juostelės. Didesnį jautrumą nei fermentais pažymėti antikūnai turi antikūnai, pažymėti trumpųjų infraraudonųjų spindulių fluorofortais. Šios technikos specifiškumas ir jautrumas gali būti padidintas pradedant nuo imunoprecipituotų baltymų, o ne nuo jų mišinio. Western bloto technikos variacijos rutiniškai naudojamos nustatyti specifinius ŽIV antigenams antikūnus pacientų serumuose. 

Žymėjimas ir nustatymas antigenų ląstelėse ir audiniuose

Ekspresuojamiems ant arba viduje atskirų ląstelių tipų antigenams specifiniai antikūnai yra naudojami šioms ląstelėms identifikuoti audiniuose ar ląstelių suspensijose ir išskirti iš jų. Šiuose metoduose antikūnai gali būti pažymėti radioizotopu, fermentu, o dažniausiai fluoro chromu. Antikūnai, prijungti prie magnetinių dalelių, gali būti naudojami specifinius antigenus ekspresuojančioms ląstelėms fiziškai išskirti.

Tėkmės citometrija. Ląstelių priklausymas audiniams, subrendimo stadija ar aktyvinimo būsena dažnai nustatoma pagal ląstelių paviršiaus ar viduląstelines ekspresuojamas molekules. Šioje technikoje naudojamas ląstelių dažymas antikūnais, pažymėtais fluorochromais. Tokie antikūnai rišasi prie sau specifinių molekulių ir ląstelių išspinduliuotas fluorescencijos kiekis išmatuojamas tėkmės citometru (7 pav.). Tėkmės citometras gali nustatyti individualių ląstelių, esančių suspensijoje, fluorescenciją ir įvertinti jas kiekybiškai.

7

7 pav. Tėkmės citometrijos ir fluorescencija aktyvuotų ląstelių sortiravimo principas. 

Tėkmės citometrija – metodas, kuriuo matuojamos, charakterizuojamos ląstelės, bakterijos ir mikrodalelės ir analizuojama daug ląstelių fiziologinių parametrų. Matuojamas ląstelių santykinis dydis, granuliškumas, fluorescencija, atliekamas jų kiekybinis įvertinimas, paviršiaus markerių nustatymas (ląstelių imunofenotipavimas), ląstelių aktyvacijos nustatymas pagal paviršiaus markerių ekspresiją, viduląstelinių baltymų ar jų ekspresijos nustatymas, ląstelių transfekcijos efektyvumo tikrinimas, ląstelės ciklo analizė (DNR santykinio kiekio nustatymas), tiriama apoptozė, nekrozė (apoptotinių ląstelių identifikavimas pagal DNR dažus – propidijaus jodidą; gyvų, apoptotinių bei nekrotinių ląstelių identifikavimas aneksinu V), atliekamos funkcinės analizės (Ca2+ nustatymas; proliferacija; fagocitozė), tirpių antigenų nustatymas ir t. t. Modernūs tėkmės citometrai vienu metu gali nustatyti tris ir daugiau skirtingų fluorescencinių signalų, prijungtų prie skirtingų antikūnų. Fluorescencija aktyvuotų ląstelių sorteris yra tėkmės citometro papildomas įrenginys, leidžiantis išskirti ląstelių populiacijas pagal jų prijungiamų fluorescuojančių žymeklių rūšį ir kiekį. Paprastai ląstelės dažomos su fluorescenciniais dažais žymėtais antikūnais ir pagal fluorescenciją, taip pat pagal dydį bei granuliuotumą sortiruojamos ląstelių sorteriais (žr. 8 pav.). Ląstelės gali būti pažymėtos antikūnų-fluorochromų žymekliais ex vivo arba, tiriant eksperimentinius gyvūnus, in vivo ekspresuojant transgenus, koduojančius fluorescuojančius baltymus, tokius kaip žaliąjį fluorescuojantį baltymą. 

Kita dažnai naudojama ląstelių išskyrimo technika yra ląstelių skyrimas magnetiniais rutuliukais: MACS magnetiniai rutuliukai, Dinac magnetiniai rutuliukai, „Steam cell technology“ sistemos ir kt. Antikūnai prieš ląstelių paviršiaus žymenis yra prikabinami prie magnetinių rutuliukų, magnetiniai rutuliukai inkubuojami su ląstelėmis ir prisikabina prie ląstelių, turinčių atitinkamus žymenys. Toliau magnetu pažymėtos ląstelės yra surenkamos.

Imunofluorescencija ir imunohistochemija

Antikūnai gali būti naudojami anatominiam antigenų pasiskirstymui audiniuose arba tarp ląstelių populiacijų identifikuoti. Tam tikslui fluorochromais ar fermentais pažymėti antikūnai inkubuojami su audiniais ar ląstelėmis ir žymės vieta nustatoma tinkamu mikroskopu. Imunohistochemija ir imunocitochemija – antigenų nustatymas audiniuose ir ląstelių kultūrose imunocheminiais metodais – šviesiniu mikroskopu. Imunohistofluorescencija ir imunocitofluorescencija – antigenų nustatymas audiniuose ir ląstelių kultūrose imunofluorescenciniais metodais – fluorescenciniu mikroskopu. Histologinių audinių pjūvių paruošimas, preparatų dažymas naudojant antikūnus: antikūnai, žymėti fermentu arba fluorescenciniais dažais, rezultatų vizualizavimas šviesiniu arba fluorescenciniu mikroskopu ir moderniausiais – konfokaliniu ir dvifotoniu – mikroskopais. Populiariausias metodas – imunoperoksidazinė technika arba šarminės fosfatazės technika. Antikūnai pririšti prie koloidinio aukso – vizualizuojama elektroniniu mikroskopu – imunoelektroninė mikroskopija. Galimi tiesioginiai ir netiesioginiai imunomikroskopiniai metodai.

Transgeninių pelių modeliai

Specifinių genų produktų funkciniams tyrimams in vivo naudojami trys svarbūs ir tarpusavyje susiję pelių modeliai: 1) įprastų transgeninių pelių sukūrimas, kurios ektopiškai (neįprastoje vietoje) ekspresuoja tam tikrą geną; 2) „knockout“ pelių sukūrimas, t. y. tam tikro geno suardymas ar mutavimas; 3) „knockin“ pelių sukūrimas, kai gemalinėje linijoje egzistuojantis genas pakeičiamas modifikuota to paties geno versija. Pastaruoju atveju normalų geną galima pakeisti mutantiniu arba atvirkščiai. Šios genetiškai sukonstruotos pelės labai plačiai naudojamos tiriant įvairius biologinius fenomenus, įskaitant limfocitų vystymąsi, aktyvinimą ir tolerantiškumą.

Įprastos transgeninės pelės kuriamos svetimas DNR sekas, vadinamus transgenus, įterpiant į apvaisintų pelių kiaušinėlių pronukleusus ir tuos kiaušinėlius implantuojant į pseudonėščių pelių kiaušintakius. Paprastai įvedus kelis šimtus geno kopijų į branduolį apie 25 % gimusių pelių būna transgeninės. Nuo 1 iki 50 transgeno kopijų, įterptų kartu į atsitiktinę chromosomos vietą, toliau paveldimos pagal įprastus Mendelio dėsnius. Kadangi genų integracija paprastai įvyksta prieš DNR replikaciją, dauguma (apie 75 %) transgeninių naujagimių turi transgenus visose savo ląstelėse, įskaitant gemalines ląsteles. Dauguma atvejų svetimos DNR įterpimas nesuardo endogeninių genų funkcijų. Taip pat visos transgeninės pelės yra heterozigotinės, ir iš jų reikia išvesti homozigotines linijas.

Transgeninių technologijų didelis pranašumas yra tai, kad jos gali būti naudojamos genų ekspresijai tam tikruose audiniuose tirti, prijungiant koduojančias genų sekas prie reguliuojančių sekų, kurios paprastai nulemia genų ekspresiją tik tame audinyje. Pvz., limfoidiniai promotoriai ir enhanceriai gali būti naudojami ekspresuoti pertvarkytus receptorių antigenams genus limfocituose, o insulino promotorius gali būti naudojamas ekspresuoti genus kepenų salelių β ląstelėse. Transgenai plačiai naudojami imunologiniuose tyrimuose, vaistų, hormonų poveikio tyrimuose ir t. t.

Atskiro geno suardymo pelių modeliai yra būdas nustatyti to geno atliekamas funkcijas in vivo. Tam sukuriamos „knockout“ pelės mutuojant arba suardant geną. Ši technika paremta homologinės rekombinacijos fenomenu. Jeigu egzogeninis genas yra įterpiamas į ląstelę, pvz., elektroporacijos būdu, jis gali atsitiktinai integruotis į ląstelės genomą. Tačiau, jei genas turi homologines endogeniniam genui sekas, jis greičiausiai rekombinuos su endogeninėmis sekomis ir jas pakeis. Homologinę rekombinaciją patyrusių ląstelių atrankai naudojamas atsparumas vaistams. Į ląstelę įterpiamas homologinis DNR segmentas yra įstatomas į vektorių, turintį atsparumo neomicinui geną ir virusinės timidino kinazės (tk) geną. Šis taikininis vektorius sukonstruojamas taip, kad atsparumo neomicinui genas visada įterpiamas į chromosominę DNR, o tk genas prarandamas kai tik įvyksta homologinė rekombinacija (bet neatsitiktinis įsiterpimas). Ląstelės auginamos įdėjus neomicino ir gancikloviro, vaisto, kurį metabolizuoja timidino kinazė iki letalaus produkto. Ląstelės, kuriose genas integruojasi atsitiktinai, bus atsparios neomicinui, bet bus nužudomos gancikloviro, o ląstelės, kuriose įvyksta homologinė rekombinacija, bus atsparios abiems vaistams, nes tk genas nebus įjungtas. Šia pozityvia-negatyvia selekcija užtikrinama, kad išgyvens tik homologinę rekombinaciją su endogeninėmis sekomis patyrusios ląstelės. Įterpta DNR į endogeninio geno vidurį paprastai suardo koduojančias sekas ir pašalina šio geno ekspresiją arba funkcionavimą. Be to, galima taip sukonstruoti taikininį vektorių, kad homologinė rekombinacija sukels vieno ar kelių endogeninio geno egzonų pašalinimą (deleciją) (8 pav.).

8

8 pav. „Knockout“ geno sukūrimas. Geno X suardymas embrioninėse kamieninėse (EK) ląstelėse įvyksta homologinės rekombinacijos metu. EK ląstelių populiacija yra transfekuojama taikininiu vektoriumi, turinčiu dviejų X geno egzonų homologines sekas, kurios supa atsparumo neomicinui (neo) geną. Neo genas pakeičia ar suardo vieną iš X geno egzonų homologinės rekombinacijos metu. Timidino kinazės (tk) genas bus įterptas į genomą tik atsitiktinės, nehomologinės rekombinacijos metu.

Kuriant „knockout“ peles, pirmiausia taikininiu vektoriumi suardomas norimas genas pelių embrioninių kamieninių (EK) ląstelių linijoje. EK ląstelės yra daugiagalės, galinčios augti kultūroje, o suleistos į pelių blastocistą gali būti implantuotos į pseudonėščias motinas ir ten vystytis iki gimimo. Svarbiausia, EK ląstelių palikuonys normaliai vystosi į subrendusius audinius, kuriuose bus ekspresuojami egzogeniniai genai, transfekuoti į EK ląsteles. Taigi, taikininis vektorius įterpiamas į EK ląsteles, ir kolonijos, kuriose įvyko homologinė rekombinacija (vienoje chromosomoje), yra atrenkamos vaistais. Atrinktos EK ląstelės injekuojamos į blastocistas, kurios implantuojamos pseudonėščioms patelėms. Gimusios pelės bus chimerinės pagal heterozigotinį suardymą ar mutaciją, t. y. kai kurie audiniai išsivystys iš EK ląstelių, o kiti iš normalių blastocistos ląstelių. Gemalinės ląstelės taip pat paprastai yra chimerinės, bet kadangi šios ląstelės yra haploidinės, tik kai kurios jų turės chromosomas su suardytu (mutuotu) genu. Jeigu chimerinės pelės suporuojamos su normaliomis (laukinio tipo) pelėmis, visos jų palikuonių ląstelės bus heterozigotinės šiai mutacijai (vadinamasis perdavimas gemaline linija). Tokios heterozigotinės pelės toliau poruojamos ir gaunami šios mutacijos homozigotai – „knockout“ pelės, neekspresuojančios taikininio geno (9 pav.).

9

9 pav. Taikininiu vektoriumi transfekuotos EK ląstelės yra atrenkamos neomicinu ir gancikloviru. Išgyvena tik homologinę rekombinaciją patyrusios ląstelės, kurios suleidžiamos į blastocistą. Blastocista implantuojama į pseudonėščių pelių gimdą. Gimsta chimerinės pelės, kuriose atskiri audiniai yra kilę iš EK ląstelių, turinčių mutaciją X gene. Chimerinės pelės identifikuojamos pagal mišrią kailio spalvą, kilusią iš pelių – EK ląstelių donorių ir pelių – blastocistų donorių. Jeigu mutacija yra gemalinėse ląstelėse, ji toliau gali būti palaikoma chimerinių pelių kryžminimu.

Homologinė rekombinacija taip pat gali būti naudojama pakeisti normalią genų seką modifikuota to paties geno seka (arba kitu genu), tokiu būdu sukuriant „knockin“ pelių liniją. „Knockin“ pelės gali būti naudojamos tirti vienos bazės pokyčio pasekmes. „Knockin“ metodas iš principo gali būti naudojamas pakeisti defektyvų geną normaliu. Tam tikrais atvejais įvairūs genai gali būti patalpinami į numatytas genomo vietas naudojant „knockin“ strategiją, o ne į atsitiktines vietas, kas vyksta paprastose transgeninėse pelėse. „Knockin“ strategija naudojama, kai norima turėti transgeno ekspresiją, reguliuojamą tam tikromis endogeninėmis DNR sekomis, tokiomis kaip enhancerio ar promotoriaus sritys. Tokiu atveju taikininis vektorius turi egzogeninį geną, koduojantį norimą produktą, taip pat sekas, homologines endogeniniam genui, kurios nutaikytos į rekombinacijos vietą.

Nors įprasta genų-taikinių strategija yra labai naudinga imunologiniuose tyrimuose, ši technologija turi ir kelis apribojimus. Pirmas, vystymosi metu vieno geno mutacija gali būti kompensuojama pasikeitusia kito geno produktų ekspresija, todėl taikininio geno funkcija gali būti sunkiai pastebima. Antras, „knockout“ geno pelėse geno svarba tik viename audinyje ar tik vieną kartą vystymosi metu yra sunkiai įvertinama. Trečias, funkcinis atrankos markerinis genas, toks kaip atsparumo neomicinui genas, ilgam įvedamas į gyvūnų genomą, ir toks pokytis gali sukelti nenuspėjamus padarinius gyvūnų fenotipui. Pastaruoju metu „knockout“ genų technologija buvo patobulinta taip, kad išvengiama visų paminėtų trūkumų. Sukurta „sąlyginė“ strategija panaudojant bakteriofagų Cre/loxP rekombinacijos sistemą. Cre fermentas yra DNR rekombinazė, kuri atpažįsta 34-bp sekos motyvą, vadinamą loxP, ir fermentas pašalina geno segmentus, iš abiejų pusių apsuptus dviejų loxP. Pelėms su loxP pažymėtais genais sukurti taikininiai vektoriai yra konstruojami su viena loxP vieta iš vienos atsparumo neomicinui geno pusės ir kita loxP vieta, kuri yra taikiniui homologinių sekų gale. Šie vektoriai transfekuojami į EK ląsteles, ir pelės, turinčios loxP-apsuptus, bet vis dar funkcionuojančius taikininius genus, yra sukuriamos kaip aprašyta „knockout“ pelių kūrime. Kita pelių linija, turinti cre transgeną, tada sukryžminama su loxP-apsupto taikininio geno nešiotoja. Jų palikuonyse cre rekombinazės ekspresija pašalina taikininį geną. Pašalinamos ir normalaus geno sekos ir atsparumo neomicinui genas. Svarbiausia, cre geno ekspresija, o po to taikininio geno delecija gali būti apribota atskiru audiniu arba specifiniu laiku panaudojant cre transgeno konstrukcijas su skirtingais promotoriais. Pvz., selektyvi geno delecija tik helperinėse T ląstelėse gali būti atlikta panaudojant cre transgenines peles, kuriose cre valdomas CD4 promotoriaus. Alternatyviai steroido indukuojamas promotorius gali būti panaudotas taip, kad Cre ekspresija ir tolesnė geno delecija įvyktų tik po to, kai pelės gaus dozę deksametazono. Sukurta visa eilė kitų šios technologijos variacijų, leidžiančių kurti sąlyginius mutantus. Cre/loxP technologija taip pat gali būti naudojama „knockin“ pelių sukūrimui. Tokiu atveju loxP vietos įdedamos į taikininį vektorių, apsupant atsparumo neomicinui geną ir homologines sekas, bet neapsupant pakeitimui („knockin“) naudojamų geno sekų. Todėl, po cre atliktos delecijos egzogeninis genas lieka genome numatytoje vietoje.

Literatūra

[1] Sims S, Willberg C and Klenerman P. MHC–peptide tetramers for the analysis of antigen-specific T cells. Expert Rev. Vaccines. 2010: 9(7); 765–774.
[2] Letsch A and Scheibenbogen C. Quantification and characterization of specific T-cells by antigen-specific cytokine production using ELISPOT assay or intracellular cytokine staining. Methods. 2003: 31; 143–149.
[3] Anthony DD and Lehmann PV. T-cell epitope mapping using the ELISPOT approach. Methods. 2003: 29; 260–269.
[4] Abbas AK, Lichtman AH, Pillai S. Cellular and Molecular Immunology. 7th ed. Elsevier Saunders, 2012.
[5] Anastassiadis K, Schnütgen F, von Melchner H, Stewart A F. Chapter Nine – Gene Targeting and Site-Specific Recombination in Mouse ES Cells. Methods in Enzymology. 2013, 533; 133–155.
[6] Friedel RH. Targeting embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 2009; 561:185-97. doi: 10.1007/978-1-60327-019-9_12.
[7] Kühn R, Torres RM. Cre/loxP recombination system and gene targeting. Methods Mol Biol. 2002; 180:175-204.
[8] Skvorak K, Vissel B, Homanics GE. Production of conditional point mutant knockin mice. Genesis. 2006 Jul; 44(7):345-53.
[9] Wüthrich M, Hung CY, Gern BH, Pick-Jacobs JC, Galles KJ, Filutowicz HI, Cole GT, Klein BS. A TCR transgenic mouse reactive with multiple systemic dimorphic fungi. J Immunol. 2011 Aug 1; 187(3):1421-31. 

Lecturer