mRNR vakcinos

Free Register

Tiek DNR, tiek mRNR gali būti naudojamos kaip genų terapijos įrankis. Kadangi imuninė sistema natūraliai aktyvuojama svetimomis nukleorūgštimis, kurias atpažįsta ir suriša Toll-like receptoriai (TLR) endosomose (TLR3, 7, ir 8 atpažįsta egzogeninę RNR, o TLR9 gali surišti egzogeninę DNR), pateikimas svetimų nukleorūgščių paprastai sukelia imuninį atsaką, nukreiptą prieš koduojamus baltymus. Buvo atlikta daug ikiklinikinių ir klinikinių tyrimų naudojant DNR-pagrindo eksperimentines vakcinas. Tačiau, nė vienas produktas iki šiol nepatvirtintas naudoti žmonėms. O natūraliai trumpalaikės ir citozolyje aktyvios mRNR molekulės yra galimai saugesnė ir efektyvesnė alternatyva nei DNR vakcinacija naudojant genus. Buvo parodyta, jog optimizuota mRNR (patobulintas kodonų panaudojimas, stabilumas, koduojamų baltymų antigeninio perdirbimo charakteristikos ir pan.) yra potencialus vakcinavimo įrankis, ją pateikiant gryną, liposomose, prijungtą prie dalelių ar transfekuotą į dendritines ląsteles in vitro. Klinikiniai tyrimai su žmonėmis parodė, kad grynos ar transfekuotos į dendritines ląsteles mRNR pateikimas sukelia laukiamą antigenui specifinį imuninį atsaką. Panašiai gyvūnų modeliuose savo aktyvumą pademonstravo profilaktinės vakcinos prieš virusinius patogenus ir alergenus. Šie sėkmingi darbai tęsiami ikiklinikiniuose tyrimuose taikant mRNR baltymų ir genų pakaitinę terapiją, kaip ir indukuojant daugiagales kamienines ląsteles su mRNR koduojamais transkripcijos faktoriais. Svarbiausia, mRNR gali būti gaminama dideliais kiekiais ir geros gamybinės praktikos (GGP) kokybės, kas leidžia toliau vystyti terapijas, pagrįstas mRNR. mRNR vakcinų ir vaistų gamyba yra labai lankstus, greitai padidinamas ir konkurencingas pagal kainą procesas, kuriame nereikalinga žemos temperatūros grandinė. 

Vokietijos kompanija „CureVac“, leidus šalies vyriausybei, šiuo metu atlieka IIb fazės klinikinius mRNR vakcinos nuo prostatos vėžio bandymus su pacientais, sergančiais hormonams atspariu metastazuojančiu prostatos vėžiu. Į vakcinos CV9103/9104 sudėtį įeina modifikuota ilgos grandinės mRNR molekulė, koduojanti keturis skirtingus prostatos vėžio ląstelių išskiriamus antigenus. Tai pirmoji vakcina mRNR pagrindu, skiriama tiesiai į odą, kurios ikiklinikiniai duomenys yra daug žadantys.

Įžanga

Paskutinių dešimtmečių technologiniai molekulinės biologijos laimėjimai dramatiškai pakeitė mūsų supratimą apie žmogaus ligas, jų diagnozę ir gydymą. Kritinių veiksnių nustatymas žmogaus ligų patofiziologijoje įgalino genetine atranka, transgeniniais ar „knockout“ gyvūnų modeliais įvardyti kelis svarbiausius pagrindinius veiksnius ir sukurti aukšto selektyvumo, mažų molekulių inhibitorius, blokuojančius specifinius taikinius. Tai atskirais atvejais visiškai pakeitė natūralią grėsmingų ligų eigą, pvz., su imatinib, dasatinib ir nilotinib inhibuojant onkogeninį suliejimo baltymą bcr-abl prie lėtinės mielogeninės leukemijos (Panjarian ir kt., 2013; Quintas-Cardama and Jabbour, 2013). Didėjantis mūsų sugebėjimas manipuliuoti svarbių baltymų genetiniu kodu, kuris yra jų DNR, daugeliu atvejų leidžia mums atsisakyti mažų molekulinių inhibitorių kūrimo ir, vietoj baltymų, tokių, kaip monokloniniai antikūnai diagnozei ir terapiniams tikslams naudoti rekombinantinius natūraliai susidarančius ar gerai sukonstruotus baltymus tokiu mastu, kurio beveik negalėjome įsivaizduoti dar prieš du dešimtmečius (pavyzdžiai pateikti šiuose straipsniuose) (Bargou ir kt., 2008; Bendtzen, 2012; Day ir kt., 2013; Lindsay ir kt., 2013; Ljung, 2013; Moots and Naisbett-Groet, 2012; Robak, 2012; Sellam ir kt., 2013; Specenier and Vermorken, 2013). Tačiau baltymų panaudojimas medicininiais tikslais dažnai reikalauja gera gamybine praktika (GGP) paremtų gamybos procesų, kurie techniškai ir finansiškai yra labai sunkūs ir nelabai lankstūs, nes kiekvieno baltymo gamybai reikia atskirų gamybinių patalpų.

Jau anksčiau buvo žinoma, jog baltymai iš principo gali būti ekspresuojami tiesiogiai suleidus DNR ar mesendžerinę RNR (mRNR) į organus-taikinius (Wolff ir kt., 1990). Pradiniai bandymai panaudoti šį reiškinį buvo nukreipti į nukleotidinių vakcinų sukūrimą, tačiau galimybės tokiu būdu ekspresuoti baltymus buvo vertinamos ribotai. Nors pirmi pranešimai nurodė panašų DNR ar mRNR vakcinų efektyvumą (Conry ir kt., 1995; Martinon ir kt., 1993; Tang ir kt., 1992), dauguma mokslininkų per praėjusius dešimtmečius savo pastangas skyrė DNR vakcinų kūrimui. To priežastimi buvo žinomas mRNR nestabilumas, ilgo mRNR saugojimo sunkumai ir, svarbiausia, GGP reikalavimus atitinkančios medžiagos pagaminimo kaina.

Tačiau maždaug prieš 10 metų Pascolo įrodė, jog toks požiūris yra klaidingas ir mRNR gamybos dideliu mastu kaina yra mažesnė nei DNR (Pascolo, 2004). mRNR pagrindo nukleotidinės vakcinos suteikė galimybę per labai trumpą laiką užkoduoti praktiškai bet kokius baltymus kaip antigenus ir gaminti juos pagal tą patį gamybos procesą toje pačioje gamykloje. Tokios naujos vakcinos gali būti pagamintos per labai trumpą laiką su nedidelėmis finansinėmis investicijomis, kas labai svarbu pandeminių infekcinių ligų atvejais, taip pat vėžinių vakcinų prieš pacientui specifinius su vėžiu susijusius ar mutavusius antigenus kūrime (Kreiter ir kt., 2012; Petsch ir kt., 2012). Be to, mRNR nesusijusi su įsijungimo į genomą rizika, kai DNR tokia rizika galima ne tik teoriškai. Tai suteikia mRNR didesnį saugumo pranašumą prieš DNR terapijas.

Priešingai iki šiol vyravusiems mokslininkų lūkesčiams susieti nukleotidines vakcinas su DNR, idealus pagrindas naujoms vakcinoms prieš infekcinius patogenus (Petsch ir kt., 2012) ir vėžį (Kübler ir kt., 2011; Sebastian ir kt., 2011, 2012) gali būti mRNR. mRNR vakcinavimo technologijos gali tapti pagrindinėmis technologijomis ir dėl galimybės labai sumažinti kainą (Christensen, 1997). Pastarųjų metų mRNR savybių tyrimai labai praplėtė jų panaudojimo galimybes: nuo baltymų in situ gavimo imunizuojant (Kariko ir kt., 2012; Kormann ir kt., 2011) iki mRNR indukuojamomis daugiagalėmis kamieninėmis autologinėmis ląstelėmis paremtos terapijos (Mandal and Rossi, 2013). Taigi, gali būti, jog pirmi įteisinti vaistai greičiau remsis mRNR nei tariamai mažiau komplikuota DNR (Geall ir kt., 2013; Gilboa, 2012).

DNR vakcinos

Nukleotidinės vakcinos, tiesiogiai stimuliuojančios imuninę sistemą, kartu sukeldamos ir ląstelinį imunitetą, pasirodė kaip idealus vakcinų tyrimo ir kūrimo pagrindas (Ulmer ir kt., 2012). Be to, tokių vakcinų gamyba buvo laikoma gana paprasta, nebrangia ir lengvai išplečiama bei lengvai pereinama nuo vienos vakcinos gamybos prie kitos, t. y. nuo vieno nukleotidų kodo prie kito. Kaip jau minėjome, ankstyvos pastangos sukurti vakcinas rėmėsi tiek DNR (Tang ir kt., 1992; Ulmer ir kt., 1993), tiek RNR nukleotidų (Martinon ir kt., 1993) panaudojimu, tačiau du dešimtmečius iš principo dominavo DNR vakcinų tyrimai dėl jų lengvesnio panaudojimo. DNR vakcinos sukelia gyvūnuose T- ir B-ląstelių atsakus prieš daugelį antigenų. Šie tyrimai leido sukurti komercines DNR plazmidėmis paremtas vakcinas gyvūnams: šunims įteisintą vakciną nuo melanomos (Grosenbaugh ir kt., 2011), vakciną žuvims nuo infekcinio hematopoetinio nekrozės viruso ir vakciną arkliams nuo Vakarų Nilo (West Nile) viruso (Davis ir kt., 2001; Garver ir kt., 2005; Kurath ir kt., 2006).

Tačiau iki šiol DNR vakcinų kūrimas žmogui nebuvo toks sėkmingas. Nors daug klinikinių tyrimų patvirtino DNR vakcinų sukeliamą T- ir B-ląstelių atsaką žmonėse, šių atsakų stiprumas buvo gerokai mažesnis nei gaunamas naudojant tradicinius metodus. To priežastis nėra iki galo išaiškinta, bet gali būti, jog tai susiję su būtinybe DNR vakcinoms pereiti bent per dvi ląstelines membranas (plazminę membraną ir branduolio membraną), kol pasiekiama antigenų ekspresija. Dėl to, DNR fiziniam pristatymui buvo skiriamas ypatingas dėmesys, naudojama elektroporacijos (EP) technika, įvedimas be adatų, t. y. „apšaudymas“ dalelėmis ar įvedimas aukštu slėgiu, odos pleistrais, taip pat imuninės sistemos aktyvavimas užkoduotomis imunostimuliatorinėmis molekulėmis (genetiniais adjuvantais) (Sardesai and Weiner, 2011; Ulmer ir kt., 2012). Pastarųjų metų naujų EP prietaisų tyrimai vėl atnaujino viltis sukurti DNR vakcinas. Po elektroporacijos in vivo terapinė kandidatinė vakcina prieš žmogaus papilomos virusą (HPV) 16/18, VGX-3100, sukelia stiprų imuninį atsaką prieš didelės rizikos HPV serotipų antigenus (Bagarazzi ir kt., 2012). Buvo įrodyta, jog ji pašalina HPV infekuotas ląsteles ir sumažina displazijos procesą. Neseniai sukurta kandidatė į maliarijos DNR vakcinas. Tai vakcina iš keturių sintetinių Plasmodium falciparium antigenų sekų (sporozoitą supantis baltymas, kepenų stadijos antigenas 1, su trombospondinu susijęs nežinomas baltymas ir ookinečių bei sporozoitų ląsteles kertantis skersai baltymas), įvedamų in vivo ir tiriamų ikiklinikiniuose tyrimuose dėl jų imunogeniškumo pelėse ir žemesniuosiuose primatuose. Pelėse prieš visus užkoduotus antigenus buvo nustatytas humoralinis ir ląstelinis atsakas, kurį sudarė interleukinas (IL)-2, interferonas γ (IFNγ) ir auglio nekrozės faktorius α (TNFα), gaminami CD4+ ir CD8+ T ląstelių (Ferraro ir kt., 2013). Ląstelinis atsakas nustatytas ir nežmoginiuose primatuose, ir svarbiausia, nustatytos antigenui specifinės CD8+ Granzimo B+ T ląstelės. Lu su kolegomis atliktas alternatyvus bandymas parodė, jog imunizavimas DNR vakcinomis, po to dar papildomai vakcinuojant baltymu, sukelia stiprų imuninį atsaką (Vaine ir kt., 2008; Wang ir kt., 2012). Vakcinuojant vien tiktai DNR rezultatų negauta. Dar viena nesėkmė DNR vakcinų kūrime lydėjo neseniai atliktus fazės III tyrimus su Allovectin-7 (Bedikian ir kt., 2010), bicistronine plasmide, koduojančia žmogaus leukocitų antigeną (HLA)-B7 ir β2 mikroglobuliną, sujungta su katijonine lipidų sistema, kuria buvo siekiama gauti ilgalaikį atsaką pažengusioje melanomoje (http://www.vical.com/). Teikiantys vilčių rezultatai gauti fazės II tyrimuose su TransVax, terapine DNR vakcina, nukreipta prieš citomegalo viruso glikoproteiną B ir fosfoproteiną 65 (Kharfan-Dabaja ir kt., 2012). Citomegalo virusui seroteigiamuose pacientuose po alogeninės hemopoetinių kamieninių ląstelių transplantacijos sumažėjo viremija, tačiau statistinio patikimumo nepasiekta. DNR vakcina buvo gerai toleruojama ir šiuo metu tiriama fazės III tyrimuose (http://www.vical.com/). Nežiūrint šių naujausių pasiekimų, DNR vakcinų perspektyvos neaiškios. Prie pirmiau išvardytų sunkumų prisideda ir tai, kad DNR vakcinos rizikingos dėl galimo įsijungimo į genomą. Tai patvirtinta su stabiliai transfekuotų ląstelių linijų generacijomis, kai transfekuota DNR atsitiktinai įsijungia į genomą, nors visuotinai tokia įsijungimo rizika laikoma labai maža. Tačiau per metus sveikiems žmonėms bus suleidžiama šimtai milijonų dozių profilaktinės vakcinos prieš infekcinius patogenus. Tokiomis sąlygomis net labai reti įvykiai gali įgauti rimtas pasekmes, ypač atsižvelgiant į vakarų šalyse vyraujantį požiūrį į vakcinavimą (Finnegan, 2012). Kita problema yra antigeno ekspresavimo laikas, kuris gali tęstis mėnesiais ir tai nebūtinai koreliuos su geru imuniniu atsaku. Ilgas antigenų ekspresavimas gali būti žalingas imuninei sistemai ir išsekinti T ląsteles (Han ir kt., 2010; Shin and Wherry, 2007; Wherry ir kt., 2003). Taip pat gali būti nustatytas silpnesnis DNR vakcinų poveikis žmogui nei numatomas jų naudingumas. Paskutiniais metais ypač daug dėmesio skiriama citoplazminiams DNR atpažįstantiems receptoriams, pabrėžiama jų reikšmė sukeliant nuo DNR priklausomą imuninį atsaką (Aoshi ir kt., 2011; Desmet and Ishii, 2012; Marichal ir kt., 2011). Visiškai įmanoma, jog be sudėtingų įvedimo metodų į citoplazmą nepateks pakankamas DNR kiekis arba jog egzistuoja rūšiniai receptorių jautrumo DNR stimuliavimui skirtumai. Abu šie veiksniai gali pabloginti DNR vakcinų efektyvumą žmonėse.

mRNR vakcinų perspektyvos

Galimybę naudoti baltymų ekspresijai mRNA pirmą kartą parodė Wolff ir kolegos, sėkmingai ekspresavę įvairius baltymus, suleisdami į pelių raumenis jų mRNR (Wolff ir kt., 1990). Paskelbtas pirmas pranešimas apie sėkmingą mRNR vakciną, kuri pelėse sukėlė citotoksinių T limfocitų nuo gripo viruso atsiradimą. Pelės buvo imunizuojamos liposomomis, turinčiomis gripo viruso nukleoproteiną koduojančią mRNR (Martinon ir kt., 1993). Taip pat tiesiogiai į pelių raumenis pakartotinai suleidžiant karcinoembrioninį antigeną (CEA) koduojančią mRNR parodyta, jog mRNR apsauga liposomomis nebūtina (Conry ir kt., 1995). Imunizuotose pelėse pasigamino CEA specifiniai antikūnai. Kontrolinėse pelėse, negavusiose mRNR, antikūnai nepasigamino. Po penkerių metų įvyko didelis šuolis į priekį parodžius, jog esminis humoralinis ir ląstelinis imuniniai atsakai gali būti tiesiogiai sukeliami suleidžiant užkoduotus antigenus kaip pliką (neapsaugotą) arba protaminu-apsaugotą mRNR į pelių ausies kaušelį (Hoerr ir kt., 2000). Sukeltas imuninis atsakas buvo specifinis antigenui ir, svarbiausia, funkcionuojantis, kas įrodyta indukuotų T ląstelių sugebėjimu lizuoti antigenus ekspresuojančias ląsteles. Šie pirmieji eksperimentai nustatė, kad mRNR gali būti naudojama genų terapijai ar genų pakeitimui, taip pat sukėlimui apsauginio ląstelinio ar humoralinio imuniteto. Buvo pasiūlyta, jog tai ypač naudinga imuninio atsako prieš protoonkogeno produktą ar augimo faktorių sukėlimui, kurių užsitęsusi ekspresija galimai sukelia malignantinę transformaciją (Conry ir kt., 1995).

Sunkumai, susiję su gamyba

Įprastų laboratorinių eksperimentų patirtis tarp tyrėjų leido įsivyrauti nuomonei, jog RNR yra labai nestabili molekulė ir su ja sunku dirbti. Šį požiūrį labai lemia visur esančios RNazės, kurios gali greitai degraduoti RNR ir sugadinti eksperimentus, jei nepaisoma reikalingų priemonių. Tačiau žiūrint į chemines charakteristikas, RNR yra labai stabili molekulė fiziologinėmis sąlygomis. F. von der Mülbe grupė iš CureVac parodė, jog taikininė RNR gali būti lengvai pagaminama nuo linijinio plazmidės DNR šablono transkribuojant RNR polimerazei, po to fermentiniu būdu suardant DNR šabloną DNazėmis ir išvalant pagamintą mRNR precipitacija ir chromatografiniais metodais pagal jų dydį (1 paveikslas; detalus aprašymas pateiktas Ketterer ir kolegų, taip pat Pascolo) (Ketterer ir kt., 2008; Pascolo, 2004, 2006). Gaunamas labai švarus RNR produktas, kuris gerai dirba kaip kelių kilobazių dydžio standartinė mRNR, taip pat šis metodas gali būti sėkmingai naudojamas pagaminti mRNR iki 15 kb dydžio. Vakcinų terminis nestabilumas gali kelti dideles pervežimo problemas, ypač šalyse, kurių infrastruktūra neturi šalčio grandinės. Šią problemą išsprendžia tyrimai, jog mRNR pagrindo vakcinas galima liofilizuoti išlaikant jų visą biologinį aktyvumą (Petsch ir kt., 2012). Tai taip pat įrodyta liofilizuotas mRNR vakcinas laikant temperatūrinio streso pagal Tarptautinės harmonizavimo konferencijos (International Conference on Harmonisation) sąlygomis atitinkamai esant 25 ir 40 °C temperatūrai kelerius metus ar mėnesius. Net ekstremaliomis streso sąlygomis 60 °C temperatūroje, stabilumas gali išsilaikyti kelis mėnesius. Šiuo metu vykstantys bandymai rodo, jog reikalaujami periodai gali būti net gerokai pailginti (F. von der Mülbe, asmeninė informacija).

Paprastai gamybos procese vengiama naudoti problemines startines medžiagas, tokias, kaip gyvūnų kilmės pagrindinius komponentus, ir stengiamasi užtikrinti aukštą atsikartojamumą tarp gamybinių partijų. Be to, labai gerai, kai tas pats gamybos procesas gali būti naudojamas daugeliui skirtingų vakcinų. Tokiu būdu išvengiama daugelio brangių gamybinių etapų, reikalingų validuojant produktą pagal reikalavimus. mRNR gamybos procesą galima lengvai pritaikyti prie GGP reikalavimų, visas gamybos procesas yra labai lankstus ir lengvai padidinamas, nauja vakcina gali būti pradėta gaminti per kelias dienas ir procesas gali būti padidinamas iki milijonų vakcinos dozių arba vienoje didelėje gamykloje arba keliose mažesnėse. Atlikus tikslią analizę nustatyta, jog tokiame procese gaminama pramoninio dydžio vakcina prekių rinkoje bus konkurencinga ir kainuos tiek pat, kiek gripo vakcina (Petsch ir kt., 2012). Iš tikrųjų, priešingai vyraujančiai nuomonei, mRNR pagrindo imunoterapija nėra brangesnė nei kitos strategijos, tokios, kaip baltymų, peptidų, DNR, ląstelių ar rekombinantinių patogenų, netgi gali būti pigesnė (Pascolo, 2004).

1

1 pav. Mesendžerinės RNR (mRNA) gamyba ir terminis stabilumas. (a) CureVac’s geros gamybos praktikos (GGP) mRNR gamybos pagrindas. Visi atskiri proceso etapai atliekami GGP sąlygomis. Šiomis sąlygomis galima lygiagrečiai gaminti daugelį vakcinų. Visas procesas atliekamas per kelias savaites su 39 kokybės kontrolėmis. (b) CureVac sukūrė padidinamą, patentuotą mRNR gryninimo procesą (PUREmessenger). Priemaišos pašalinamos chromatografija, gaunama gerokai švaresnė mRNA, nei valant standartiniais metodais. Labai švari mRNA pasižymi didesne ekspresija.

Ex vivo dendritinių ląstelių transfekcija mRNA

Praktiškai bet kokios ląstelės gali būti transfekuotos su mRNR, įskaitant ir dendritines ląsteles (DCs) (Breckpot ir kt., 2004). DCs ir kitos profesionalios ir pusiau-profesionalios antigenus pateikiančios ląstelės (APCs) yra svarbiausios pradedant efektyvų imuninį atsaką CD4 ir CD8 ląstelėmis prieš mRNR koduojamus antigenus. Galimybė mRNR užkoduoti bet kokį antigeną ir galimybė gaminti mRNR dideliais kiekiais GGP sąlygomis jau anksčiau buvo naudojama gamybiniams vakcinacijų strategijų kūrimams, sutelkiant dėmesį į ex vivo APC transfekciją (Boczkowski ir kt., 1996; Gilboa and Vieweg, 2004; Sullenger and Gilboa, 2002). Galima paminėti transfekciją su chimerinius antigenus, II klasės MHC pateikimo sustiprinimui taikininius endosomų antigenus koduojančia mRNR, su įvairiomis mRNR, koduojančiomis antigenų junginius, ir panaudojimą kitų APC, ne tik DC, imuninės sistemos stimuliavimui (Bonehill ir kt., 2003; Breckpot ir kt., 2003; Gilboa, 2007; O’Neill ir kt., 2004; Okada ir kt., 2005; Van den Bosch ir kt., 2006). Tačiau pagrindinė kliūtis vakcinavimui su DC buvo eksperimentų, lyginančių ex vivo sukurtų, peptidais pakrautų DC imunoterapijas su standartine chemoterapija pacientuose su pažengusia melanoma nebūvimas (Schadendorf ir kt., 2006). Iki šiol teigiama, kad DC aktyvinimas turi išlikti sėkmingos imunoterapijos kertiniu akmeniu ir turi būti skatinami nauji tyrimai (detali analizė pateikta Gilboa, Van Lint ir kolegų) (Gilboa, 2007; Van Lint ir kt., 2013).

Vieną iš tokių metodikų sukūrė Thielemann ir kolegos. Jie DC aktyvavimui paruošė kokteilį iš trijų skirtingų imunostimuliatorinių molekulių (Bonehill ir kt., 2008). Imunostimuliatorinį kokteilį sudarė pagrindinio aktyvaus toll-like receptoriaus 4 (TLR4) variantas (caTLR4), CD40L, kuris aktyvuoja T ląsteles susirišus su CD40 ir CD70, kuris, susirišęs su CD27, pateikia T ląstelėms išlikimo ir proliferacijos signalus. Šios molekulės buvo pateikiamos kartu su tiriamu antigenu, sujungtu su II klasės MHC. Su šia vadinamąja „TriMix“ mRNA subrandintos DC daugiau nei 200 kartų efektyviau aktyvino specifines T ląsteles prieš užkoduotą antigeną nei klasikiniu stimuliuojančių citokinų kokteiliu, sudarytu iš IL-1β, TNFα, IL-6 ir prostaglandino E2, subrandintos DC (Bonehill ir kt., 2008). Neseniai pasirodę straipsniai nurodo, jog produktyvus imuninis T ląstelių atsakas sukeliamas tik tam tikra slenkstine antigeno doze (Henrickson ir kt., 2008), ir taip pat mRNR panaudojimas ir tolesnis antigeno ekspresavimas vyksta tik nesubrendusiose DC (Diken ir kt., 2011; Van Lint ir kt., 2012). 

Pirmas bandymas pacientuose su pažengusia melanoma buvo atliktas panaudojant TriMix-DC terapiją su užkoduotais su melanoma susijusiais antigenais (MAAs) MAGE-A3, MAGE-C2, tirozinaze ar gp100, sujungtais su II klasės HLA molekulėmis (Van Nuffel ir kt., 2012b; Wilgenhof ir kt., 2011b). MAGE-A3 ir -C2 buvo pririšti prie lamp1 signalinio peptido N galo, užtikrinant transportavimą į endoplazminį tinklą. Susidarė funkcionalios CD8+ ir CD4+ T ląstelės, atpažįstančios užkoduotų antigenų epitopus, pateikiamus su skirtingais HLA tipais. Svarbiausia, suliejimo metu susidarę neoepitopai taip pat buvo atpažįstami CD8+ ir CD4+ T ląstelių. Tai patvirtina, kad ex vivo su TriMix mRNR subrandintos DCs pacientuose su melanoma gali iššaukti efektorines CD8+ ir CD4+ T ląsteles iš naivių T-ląstelių populiacijos (Van Nuffel ir kt., 2012b).

Kitame bandyme buvo tiriama keturių vakcinacijų į odą su šia TriMix-DC-MEL, po to dar paveikiant IFNα2b, terapijos seka (Wilgenhof ir kt., 2011b). Neigiami poveikiai buvo silpni, sudaryti iš II laipsnio suleidimo vietos reakcijų visiems 29 pacientams ir II laipsnio letargijos ir karščiavimo dviem pacientams. Po keturių vakcinacijų 51,7 % (12/21) pacientų buvo nustatytas antigenui specifinis atsakas. Iš 17 įvertintų pradiniame ligos taške pacientų vienas patyrė dalinę remisiją ir penki stabilią ligos eigą (trukmė daugiau nei 6 mėnesiai su metastazių regresija) (Wilgenhof ir kt., 2011b). Kai kuriuose autologine RNR DC terapija paveiktuose pacientuose klinikinės eigos vertinimas pagal imuninio atsako kriterijus parodė, jog imunoterapija nustato naują pusiausvyrą tarp auglio (augimo greičio) ir vėžio imuninės priežiūros (Dunn ir kt., 2004; Gulley and Drake, 2011; Madan ir kt., 2012; Wilgenhof ir kt., 2011a). Šiais pasiekimais stengiamasi padidinti priešnavikinį poveikį, apjungiant RNR DC terapiją su neseniai patvirtintu kontrolinio taško (checkpoint) inhibitoriumi ipilimumab. Gauti padrąsinantys rezultatai (ClinicalTrials.gov identifier: NCT01302496) (Neyns ir kt., 2012).

Įvertinta ir apjungta intraveninė ir į odą terapija su TriMix-DC-MEL. Ypač sėkmingi rezultatai buvo stebimi pacientuose su IVc stadijos melanoma ir plaučių, limfmazgių, kaulų ir kepenų metastazėmis, kurie buvo atsparūs darcarbazinui. Nustatytas platus CD8+ ir CD4+ T-ląstelių atsakas į MAA ir pacientai parodė žymų objektyvų klinikinį atsaką (Van Nuffel ir kt., 2012a). Užbaigtas Ib fazės bandymas 15 pacientų su prieš tai gydyta pažengusia melanoma davė dvi pilnas ir dvi dalines remisijas. Teigiamai atsakiusiuose į gydymą liga neprogresavo atitinkamai 24+, 28+, 33+ ir 34+ mėnesius (Wilgenhof ir kt., 2013). TriMix-MEL klinikinių bandymų imunoanalizė parodė, kad funkcionalios specifinės CD8+ T ląstelės pasiskirsčiusios tiek pacientų odoje, tiek periferiniame kraujyje. Tačiau dalyje pacientų tik odos arba tik kraujo CD8+ ląstelės atpažino daugumą epitopų, kas rodo, jog imuniniame atsake į TriMix-DC-MEL terapiją taip pat gali būti svarbus tam tikras pasidalijimas (Benteyn ir kt., 2013; Van Nuffel ir kt., 2012b).

Svarbus žingsnis į priekį buvo atliktas visai neseniai tyrimuose, kuriuose palygintas tiesioginis TriMix mRNR, nukreiptos prieš TRP2, WT1 ar kiaušinio albuminą, įvedimas į limfmazgį ir stimuliuotų ex vivo su TriMix mRNR DC įvedimas (Van Lint ir kt., 2012). Injekcijos į limfmazgius sukūrė uždegiminę aplinką su ekspresavimu II klasės MHC molekulių, uždegiminių citokinų ir chemokinų, tokių kaip IL-6, IL-15, IFNγ, monocitų chemotaktinio baltymo 1 ir interferono indukuojamo baltymo 10, granzimų B, kurie indukavo antigenui specifines CD4+ ir CD8+ T ląsteles. Priešingai DC subrandinimui su klasikiniu citokinų kokteiliu, su TriMix sukeltas subrendimas netrukdo CD11c+ DC įsisavinti mRNR. Tiesioginis vakcinavimas su TriMix mRNA į limfmazgius buvo toks pat efektyvus kaip ir TriMix-DC terapija, sukeliant citolitinius T limfocitus ir terapinius atsakus įvairiuose pelių modeliuose (Van Lint ir kt., 2012). Kadangi klinikinė sėkmė jau buvo žinoma naudojant TriMix-DC terapiją, galima buvo tikėtis, kad TriMix mRNR kokteilio injekcija į limfmazgį bus panaši savo efektyvumu terapijai su autologinėmis paruoštomis ex vivo su mRNR DC.

DC vakcinavimas taip pat buvo pasiūlytas kaip funkcinis žmogaus imunodeficito (ŽIV) viruso gydymo būdas po tradicinio gydymo, žymiai sumažinančio viruso dalelių kiekį (Vanham and Van Gulck, 2012). Buvo parodytas šios idėjos tinkamumas žmonėms (Van Gulck ir kt., 2012). Eksperimentai su mRNR vakcinomis prieš ŽIV taikininius antigenus, įkapsuliuotus katijoniniais lipidais, parodė, jog tokios vakcinos gali būti naudojamos vakcinacijai po oda (Pollard ir kt., 2013). Mūsų aprašytas TriMix panaudojimas rodo technologinę pažangą, kai vakcinacijos su DC sėkmė yra perkelta į tiesioginį naujų mRNR vakcinų pristatymą, kurios pritaikomos daug platesnei pacientų populiacijai.

mRNA vakcinų taikymas vakcinavimui į limfmazgius

Atsižvelgdami į jau mūsų paminėtus tyrimus Sahin ir kolegos nusprendė sukonstruoti mRNR molekules, kurių charakteristikos leistų jas tiesiogiai injekuoti in vivo, išvengiant poreikio vakcinuoti DCs. mRNR koduojamų antigenų transliacijos efektyvumas buvo optimizuotas modifikuojant poly(A) galo ilgį ir struktūrą, taip pat 3` netransliuojamą sritį (UTR) tarp atviro skaitymo rėmelio (ORF) ir poly(A)-galo (Holtkamp ir kt., 2006). Buvo nustatytas kaip optimalus poly(A) 120 nukleotidų ilgio galas, kurio pabaiga nepaslėpta ir toliau neseka nereikalingi nukleotidai, susidarę klonavimo procedūroje. Be to, kiekvienas 3’ UTR, sudarytas iš dviejų nuoseklių β-globino sričių, klonuotų nuo pradžios iki galo tarp koduojamos srities ir poly(A) galo, nepriklausomai padidino RNR stabilumą ir transliaciją (Holtkamp ir kt., 2006). Kitas antigeno pateikimo patobulinimas buvo gautas pridedant I klasės MHC signalinį peptidą prie antigeno N galo ir I klasės MHC transportavimo signalą (MITD) prie antigeno C galo (Kreiter ir kt., 2008). Transfekuotos su RNR, koduojančią tokius antigeno-MITD sulietus baltymus, DCs turėjo gerokai aukštesnį sugebėjimą stimuliuoti nei laukinio tipo kontrolės. Įdomiausia, žmogaus ir pelių DCs pagerėjo pateikimas ne tik I klasės MHC epitopų, bet taip pat ir II klasės epitopų. Tai buvo aiškinama MHC molekulių dinaminio transportavimo pamėgdžiojimu nesubrendusiose ir subrendusiose DCs. Buvo pabrėžtas prie sulietų baltymų prijungtų sekretuojamų signalinių peptidų vaidmuo, kurie gali pagerinti antigenų perdirbimą, pagerindami baltymų degradavimą endoplazminiame tinkle šalia proteosomų, ir priėjimą prie transporterių, susijusių su antigeno transportavimo (TAP) molekulėmis. Svarbiausia, pagerintas antigenų pateikimas sukelia poliepitopinį CD4+ ir CD8+ T ląstelių pasidauginimą, dėl ko susidaro atskirų specifiškumų CD8+ T ląstelės ir platus bei įvairus antigenui specifinių CD4+ repertuaras. 

Kadangi antigeno ekspresavimo lygis ir trukmė yra kritiškai svarbūs sukuriant ilgalaikį antigenui specifinį imuninį atsaką, toliau buvo tobulinamas mRNR kepurėlės struktūros modifikavimas (Kuhn ir kt., 2010). m27,2´-OGppspG (β-S-ARCA) fosforotioatinės kepurėlės padidino RNR stabilumą ir transliavimo efektyvumą, ypač gerai nesubrendusiose DC, subrendusiose – neturėjo įtakos. Tai atitinka jau minėtus tyrimų rezultatus, kad DC subrendimo laipsnis labai svarbus mRNR pasisavinimui (Diken ir kt., 2011). Kreiter ir kolegos pranešė, kad tokia modifikuota mRNR pagamina antigenui specifines CD4+ ir CD8+ T ląsteles iš naivių T ląstelių po pakartotino suleidimo į limfmazgius, bet ne po suleidimo po oda, į odą ar netoli limfmazgio. mRNR buvo pasirinktinai paimama ten esančių limfinių DC, pasidauginančių imunostimuliatorinėje aplinkoje ir sukuriančių atminties T ląsteles ir citolitines efektorines T ląsteles. Imunologinis atsakas paverčiamas į gerą priešvėžinį atsaką įvairiuose terapiniuose pelių modeliuose ir gerokai padidina išgyvenamumą (Kreiter ir kt., 2010). Šio režimo aktyvumas gali būti toliau didinamas iš anksto paveikiant peles žmogaus fms-tipo tirozino kinazės 3 (FLT3) ligando ekstraląstelinio domeno ir žmogaus imunoglobulino (Ig)-G4 sunkios grandinės pastovių sričių 2 ir 3 (CH2–CH3 domenai) sulietu baltymu, kas labai padidina mRNR terapinį poveikį. Didžiausias efektyvumas gautas su nesubrendusiomis plazmocitoidinėmis DCs ir suleidžiant FLT3 ligando/IgG4 sulieto baltymo, taip padidinant mRNA įsisavinimą (Kreiter ir kt., 2011). Tai šiuo metu tikrinama dozės padidinimo fazės I bandymuose su pažengusia melanoma, analizuojant leidžiamų į limfmazgius mRNR vakcinų, nukreiptų prieš su vėžiu susijusius antigenus, saugumą ir toleravimą (ClinicalTrials.gov identifier: NCT01684241).

Tokių optimizuotų mRNR vakcinacijų procedūrų potencialas, kuriant kuo daugiau pacientų apimančias vėžio imunoterapijas, išaiškėjo pastaruoju metu atlikus pelių B16/F10 melanomos ląstelių genomo analizę. Nustatyta, kad pelių B16/F10 melanomos ląstelės slepia apie 962 skirtingų mutacijų, iš jų 563 randamos ekspresuojamuose genuose (Castle ir kt., 2012). Detali 50 mutacijų grupės analizė parodė, kad trečdalis šių mutacijų gali būti imunogeniškos ir kad 60 % imuninio atsako yra pirmiausia nukreipta prieš mutavusias sekas, o ne prieš laukinio tipo tėvinius genus. Tai rodo, jog mRNA-pagrindo vakcinacijos gali labai tikti sukeliant platų imuninį atsaką prieš pacientų mutanomas ir atverti kelius į individualizuotą vėžio gydymą (Diken ir kt., 2013; Kreiter ir kt., 2012). Tokie technologiniai laimėjimai, kaip giluminis sekvenavimas, leidžia mums išsiaiškinti vis didėjantį žmogaus vėžinių genomų ir mutacijų juose skaičių (Biankin ir kt., 2012; Killela ir kt., 2013; Vogelstein ir kt., 2013). Nepaisant šių laimėjimų, šiandien dar negalime realiai identifikuoti kritinių mutacijų individualiuose pacientų vėžių genomuose (Ultan McDermott, Wellcome Trust Sanger Institute, Cambridge, UK, asmeniniai tyrimai). Tačiau, reikia tikėti, jog ateityje tai bus įmanoma, ir mRNR vakcinacijų technologija bus pakankamai pažengusi, sukurti reguliaciniai reikalavimai greitam individualių vėžinių vakcinų pagaminimui.

RNR replikonų panaudojimas sustiprintai baltymų ekspresijai gauti

Jau anksčiau nukleotidų koduojamų svetimų baltymų ekspresijos sustiprinimui in vivo buvo naudojamas tam tikrų RNR virusų, dažniausiai α virusų šeimos atstovų, sugebėjimas patiems pasidauginti (Johanning ir kt., 1995; Xiong ir kt., 1989; Zhou ir kt., 1994). Tokių RNR virusų struktūriniai genai yra pakeičiami reikalingais genais, o nestruktūriniai genai neliečiami, užtikrinant replikaciją ir baltymų transliaciją. Liljeström ir kolegos aprašė plazmidės koduojamą replikono sistemą, vadinamą DREP (DNR replikonas), kuri buvo sudaryta iš besireplikuojančio Semliki Forest viruso vektoriaus (replikono), sėkmingai panaudoto imunizavimui, apsaugant nuo letalaus užkrėtimo gripu (Berglund ir kt., 1998, 1999). Kiti virusai taip pat buvo naudojami kaip pagrindas tokiems replikonams (Anraku ir kt., 2002; Dubensky ir kt., 1996; Hariharan ir kt., 1998; Kirman ir kt., 2003). Kai replikono genai kartu su įterptais reikalingais genais yra nuskaitomi plazmidėje, pasidauginęs replikonas sukelia didelę baltymų ekspresiją, leidžiančią sumažinti DNR vakcinos dozę. Transfekuotose ląstelėse padidintą DNR replikonų vakcinų imunogeniškumą kartu su padidintu antigenų ekspresavimo lygiu parodo dėl replikuojančios RNR susidarę imunostimuliatoriniai ligandai, aktyvuojantys struktūras atpažįstančius receptorius, tokius kaip TLR3, RNR-aktyvuojančią proteino kinazę (PKR) ir su melanomos diferenciacija susijusį baltymą 5 (MDA5) ar retinoinės rūgšties indukuojamą geną I (RIG-I) (Diebold ir kt., 2009; Johansson ir kt., 2012; Leitner ir kt., 2000, 2003; Pichlmair ir kt., 2006; Rehwinkel ir kt., 2010; Schulz ir kt., 2005). Pratęsus šį darbą buvo paruošti RNR replikonai (RREPs), kaip saugesnė priemonė, neturinti plazmidžių ir galimo įsijungimo į genomą (Fleeton ir kt., 2000). In vitro transkribuotų plikų RREPs įvedimas į raumenis sukelia apsauginį imuninį atsaką in vivo (Fleeton ir kt., 2001). DREPs taip pat gali sukelti potencialų imuninį atsaką po įvedimo į odą (Berglund ir kt., 1998). Tai taip pat parodyta su RREPs, įvestu į odą, bet ne su taip įvesta plika mRNA. RREPs sukeltas imuninis atsakas buvo panašus į sukeltą DREPs, tačiau EP (elektroporacijos) sustiprina į odą įvesto RREPs poveikį 2 kartus, o DREPs 12 kartų. Tai susiję su padidėjusiu DREPs patekimu į branduolį po EP. Kadangi EP įvedimui į odą nėra tokia sudėtinga nei įvedimui į raumenis, tai gali būti biosaugi alternatyva vakcinavimui nukleotidais ateityje. 

Plikų, neįkapsuliuotų RNR replikonų įvedimo efektyvumas gali būti padidinamas panaudojant virusų replikonų pristatymo sistemas. Jos palengvina replikonų pristatymą į taikinines ląsteles ir sustiprina imunogeniškumą, bet susiduriama su vektoriaus imuniškumo problema (Fleeton ir kt., 2001). Bandant išvengti aukštų neutralizuojančių antikūnų titrų ir padidėjusio T-reg ląstelių kiekio po pakartotino α viruso vektorių, ekspresuojančių auglio antigeną CEA ir įkapsuliuotų į viruso tipo replikono daleles (VRPs), įvedimo pacientams su metastazuojančiu vėžiu buvo padidintos viruso dozės (Morse ir kt., 2010). Tačiau neseniai paskelbtame fazės I VRPs, ekspresuojančių prostatai specifinį membranos antigeną (PSMA), dozės padidinimo bandyme pacientuose su prostatos vėžiu buvo nustatytas tik silpnas PSMA specifinis imunofermentinio tyrimo signalas dviejų dozių grupėse. Ląstelinis imuninis atsakas tose grupėse išvis nenustatytas. Abiejose grupėse nustatyti neutralizuojantys antikūnai, kurie rodo, kad arba dozavimas buvo neoptimalus, arba kad vektoriaus imuniškumas panaikino antigenui specifinį imuninį atsaką (Slovin ir kt., 2013).

Neseniai buvo sukurta alternatyva VRPs dalelėms. Tai besireplikuojanti iš α viruso sukurta mRNR vektoriaus sistema, pavadinta SAM (angl. self-amplifying Messenger RNA), kuri koduoja respiratorinio sincicijaus viruso F baltymą ir yra įkapsuliuota sintetinių lipidų nanodalelėmis (Geall ir kt., 2012). Autoriai parodė, kad įvestos į raumenis pelėms labai mažos mRNR dozės gali sukelti labai aukštus IgG1 antikūnų titrus prieš F baltymą, taip pat ir IFNγ-gaminančias CD4+ ir CD8+ T ląsteles. Rezultatai buvo atkartoti imunogeniškumo tyrimuose žiurkėse, kuriose nevirusiniais pristatymo metodais gautas apsaugos lygis buvo panašus į gautą su vektoriais, kuriuose įstatytos VRP dalelės su besireplikuojančia mRNR (Geall ir kt., 2012). Autoriai taip pat parodė, kad lipidinėmis nanodalelėmis įkapsuliuotos SAM vakcinos sukelia funkcionalų imuninį atsaką prieš ŽIV antigenus (Geall ir kt., 2012). SAM sistema leidžia greitai pagaminti funkcionalią vakciną prieš naujus virusus, kai paskelbiamos tinkamų taikinių genų sekos. Taip per kelias savaites buvo gauta imunogeninė vakcina nuo gripo kamieno H7N9 (Hekele ir kt., 2013). Aišku, geriausias imunogeniškumas taikant SAM technologiją bus gautas naudojant bent 8 savaičių laiko tarpą tarp skirtingų vakcinavimų. Nepaisant to, panaudojimas RNR replikonų yra perspektyvus kelias plačiai paplitusiam vakcinavimui prieš daugybę infekcinių ligų (Geall ir kt., 2013). 

Įdomiausia tai, kad mRNR vakcinos dažniausiai bandomos taikyti esant alergijoms. Pastaraisiais metais alergijų skaičius labai didėja ir Vakarų šalyse greičiausiai dėl pasikeitusio gyvenimo stiliaus nuo alergijų kenčia iki 25 % gyventojų. Iš kaimų persikeliama į miestus, vaikystėje sumažėja susitikimas su mikrobais ir kartu sumažėja genų, paprastai aktyvuojančių T helperius (Th)-1, ekspresija (Weiss ir kt., 2012). Alerginis imuninis atsakas yra charakterizuojamas alergenui specifinių Th2 ląstelių vyravimu, kurios sekretuoja ‘Th2’-tipo citokinus IL-4, IL-5 ir IL-13. Šie nulemia B-ląstelių persijungimą sekretuoti alergenui specifinius IgE antikūnus, kurie rišasi prie FcεR receptorių ant putliųjų ląstelių ir bazofilų (Gould and Sutton, 2008). IL-5 sukelia eozinofilų pasidauginimą ir po pradinio kontakto su alergenu migraciją iš gleivinių paviršių į gilesnius kvėpavimo takų audinius, kas sukelia sunkias alergines patologijas, tokias kaip astma (Takatsu and Nakajima, 2008). Savo straipsniuose Thalhamer ir kolegos nustatė, kad įvairius skirtingus alergenus koduojančių DNR vakcinų sukelta alergenui specifinė Th1 poliarizacija gali apsaugoti nuo alergijos (Bauer ir kt., 2006; Scheiblhofer ir kt., 2006a, 2006b; Weiss ir kt., 2006). Kaip daug žadančios, antialerginės DNA vakcinos turi atitikti tuos pačius saugumo reikalavimus kaip ir profilaktinės vakcinos nuo infekcinių ligų. Ta pati mokslininkų grupė eksperimentų su skirtingais 29 alergenais serijoje parodė, jog apsaugant nuo alergijų RNR replikonai yra tokie pat efektyvūs kaip ir DNR vakcinos (Roesler ir kt., 2009). Iš pradžių RNR replikonai pasirodė pranašesniais nei neapsaugota RNR, lyginant pagal kiekį, tačiau penkis kartus padidinus plikos RNR dozes šio skirtumo neliko. Taigi mRNR-pagrindo vakcinos gali būti daug žadantis būdas apsisaugant nuo alergijų ir alergijų terapijai (Weiss ir kt., 2012). mRNA vakcinos taip pat gali būti patrauklios užkodavimui sukurtų hipoalerginių alergenų (Thalhamer ir kt., 2010; Wallner ir kt., 2011) ir naudojamos su neseniai sukurtu lazeriniu mikroporacijos prietaisu, kuriuo be skausmo įvedamos profilaktinės ir terapinės vakcinos į odą (Scheiblhofer ir kt., 2013).

Neįkapsuliuotų mRNA vakcinų panaudojimas: RNAktyvi technologija

Pirmiau aprašyti darbai sudarė prielaidas toliau didinti mRNR vakcinų efektyvumą arba gerinant DC subrendimą (kartu pateikiant kostimuliatorines molekules, I ar II klasės taikinius) arba didinant ekspresijos pajėgumą (replikonų panaudojimas). Kitas iš esmės skirtingas kelias yra bandomas su vadinamąja RNAktyvia (angl. RNActive) technologija: mRNR koduojamų baltymų ekspresavimas buvo labai padidintas modifikuojant mRNR sekas, o mRNR imunogeniškumas – apjungiant ją su protaminu.

Minimali mRNR struktūra yra apibrėžiama baltymą koduojančia ORF sritimi, iš abiejų pusių apsupta dviejų pagrindinių elementų 5’ ir 3’ gale: „kepurėlės“ (angl. cap), 7-metilguanozino liekanos, prijungtos prie RNR 5’ galo per 5’–5’ trifosfato jungtį, ir poly(A) uodegėlės 3’ gale (Banerjee, 1980; Wickens, 1990). Baltymų ekspresijai turi įtakos ORF UTRs 5’ (tarp kepurėlės ir ORF) ir 3’ gale (tarp ORF ir poly(A)-uodegėlės) (Schlake ir kt., 2012). Ši minimali struktūra yra nuosekliai sukonstruojama naudojant tik natūraliai randamus nukleotidus A, G, C ir U (T), nepakeičiant ORF koduojamos pirminės amino rūgščių sekos. Optimizavimas atliekamas eksperimentais identifikuojant naujus 5’ ir 3’ UTRs su palankiu poveikiu į mRNR transliaciją ir stabilumą, algoritmu optimizuojant ORF seką, taip pat ir panaudojant nustatyto ilgio poly(A)-uodegėlę. Įvairiose testavimo sistemose kartu su ypač aukštu mRNR išvalymu, liuciferazės, paprastai naudojamos kaip reporterinio geno dėl jos trumpo gyvavimo pusperiodžio (~2 h), ekspresija gali būti padidinama nuo keturių iki penkių kartų (2 pav.). Koduojamų baltymų ekspresavimo kinetika taip pat labai stipriai pasikeičia: ekspresijos pikas dabar įvyksta po 24–48 h, lyginant su ankstesne ekspresija po 72 h. Tokiu būdu CureVac`s sustiprintų RNR molekulių baltymų ekspresavimo kinetika atitinka baltymų po gripo viruso infekcijos ekspresavimo kinetiką (Julkunen ir kt., 2001).

Šios sukonstruotos sustiprintos ekspresijos mRNR sekos adjuvantiškumas buvo sukurtas sujungiant ją su protaminu. mRNR/protamino kompleksai sudaro didesnes daleles nei nesujungta į kompleksus mRNR (~250–350 nm prieš ~50 nm) ir aktyvuoja imuninę sistemą per endosomose išsidėsčiusius TLR7 (Fotin-Mleczek ir kt., 2011; Kallen ir kt., 2013; Scheel ir kt., 2005). In vitro eksperimentai parodė, kad į kompleksus nesujungta mRNR paimama nuo adenozino trifosfato priklausomo proceso metu ir po to gali būti nustatoma citoplazmoje ir lizosomose (Lorenz ir kt., 2011). Galutinė RNAktyvios vakcinos struktūra gaunama sumaišant imunostimuliuojančius mRNA/protamino kompleksus su antigeną-ekspresuojančia „plika“ sukonstruota mRNR seka. Turi būti nustatytas šių dviejų komponentų optimalus santykis ir jis turi užtikrinti tiek gerą antigeno ekspresavimą, tiek gerą imunostimuliaciją po suleidimo į odą (Fotin-Mleczek ir kt., 2011).

2

2 pav. Sukonstruotos mRNR sekos poveikis į baltymų ekspresiją. (a) Klasikinė mRNA molekulės struktūra sudaryta iš kepurėlės (angl. cap) srities, toliau sekančios (neprivalomos) 5’ netransliuojamos srities (angl. untranslated region) (UTR), atviro nuskaitymo rėmelio (angl. open reading frame)(ORF), (neprivalomo) 3’ UTR, ir poly(A)-uodegėlės (angl. poly(A)-tail). RNAktyviose vakcinose naudojamos optimizuotos mRNR molekulės pagrindą sudaro iš natūralių nukleotidų A, G, C, U sukonstruotos sekos, nedarančios įtakos ORF srities koduojamai pirminei amino rūgščių sekai. (b) Skirtingai pagamintų mRNR sekų (pvz., pagaminta optimizuojant ORF nukleotidų turinį ar įterpiant skirtingas 3’ ar 5’ UTRs ar ir tą, ir tą), koduojančių PpLuc, pagamintų per pastaruosius kelis metus in vitro ekspresuojant liuciferazę, poveikis. mRNR gaminiai, koduojantys jonvabalių liuciferazę, buvo elektroporuojami į HeLa ląsteles (gaminiai 1-4) arba transfekuojami į žmogaus odos fibroblastus lipofekcijos pagalba (gaminiai 4 ir 5) ir palyginta jų in vitro liuciferazės ekspresija. Liuciferazės kiekis buvo nustatomas 6, 24 ir 48 h arba 72 h po transfekcijos. Dinaminės tyrimo ribos neleido palyginti visų mRNR molekulių viename eksperimente. (c) Jonvabalių liuciferazę koduojanti mRNR, optimizuota pagal transliavimą ir stabilumą, buvo suleista į BALB/c pelių odą (keturios suleidimo vietos). Liuciferazės ekspresija buvo stebima gyvose pelėse skirtingais laiko tarpais po mRNR suleidimo ir maksimalus baltymų lygis buvo stebimas po 24–48 h nuo mRNR suleidimo. (d) Kiekybinė liuciferazės ekspresija iki 9 dienų po mRNR suleidimo. Rezultatai pateikti tiesinėje skalėje (kairėje pusėje) arba pusiau logaritminėje skalėje (dešinėje pusėje). Paveikslas paimtas iš Schlake ir kolegų (Schlake ir kt., 2012), smulkiau žiūrėti originalų straipsnį.

Pagal šią technologiją sukurtos dvikomponentės, adjuvantinės RNAktyvios vakcinos sukelia stiprų ir subalansuotą imuninį atsaką: Th1 ir Th2, humoralinį ir ląstelinį, taip pat yra sukeliami efektorinis ir atminties atsakai. Šiuo pagrindu gali būti gaminamos labai efektyvios vakcinos, sukeliančios stiprų CD4+ ir CD8+ T-ląstelių atsaką ir gerai veikiančios įvairiuose vėžiniuose modeliuose po pakartotino, dažno įvedimo (Fotin-Mleczek ir kt., 2011, 2012), ir kaip vakcinos nuo infekcinių ligų, tokių kaip gripas, sukeliančios apsauginį, ilgalaikį humoralinį imuninį atsaką ir reikalaujančios tik dviejų imunizacijų: įjautrinimo ir sustiprinimo (Petsch ir kt., 2012). Svarbiausia, įvairiose rūšyse nuo pelių, šeškų iki didelių kiaulių RNAktyvios vakcinos buvo efektyvios po lengvo įvedimo į odą ir nereikalavo daug komplikuotesnio įvedimo į limfmazgius (Kreiter ir kt., 2010, 2011; Van Lint ir kt., 2012). Iš tikrųjų įvedimas į odą RNAktyvių vakcinų buvo toks pat imunogeniškas kaip įvedimas įprastų mRNR vakcinų į limfmazgius (Kallen ir kt., 2013).

Šis skirtumas tarp RNAktyvių vakcinų ir kitų mRNR-pagrindo vakcinų gali susidaryti dėl padidintos baltymų ekspresijos RNAktyviose vakcinose ir palankesnio imuninės sistemos aktyvavimo būdo. Įrodyta, jog TLR7/8 aktyvavimas, sukeliantis stiprų Th1 atsaką, yra esminis DC subrandinimo naujais, gerokai patobulintais kokteiliais komponentas (Spranger ir kt., 2010, 2012). Dar daugiau, naujai sukurtos mažos TLR7/8 agonistų molekulės išsidėsto šalia II klasės MHC molekulių žmogaus plazmacitoidinėse DC (Iavarone ir kt., 2011; Russo ir kt., 2011). Šių ląstelių gaminami I tipo interferonai IFNα ir IFNβ sukelia stiprų imuninį atsaką, ypač Th1 atminties atsaką, kuris reikalingas atmesti auglį (Desmet and Ishii, 2012; Diamond ir kt., 2011). Todėl TLR7/8 aktyvavimas gali būti ypač naudingas aktyvuojant imuninę sistemą ne tik nugalėti vėžį, bet taip pat sėkmingai vakcinavimo strategijai prieš lėtines infekcijas (Bernstein ir kt., 2012; Mbow ir kt., 2010; Walsh ir kt., 2012). Be to, ekspresavimas skirtingų TLRs yra specifinis ląstelės tipui, kas reiškia, jog skirtingos APCs specifiškai reaguoja į aktyvatorius, tokius kaip su patogenais susijusios molekulinės struktūros ar endogeninės su pažeidimais susijusios molekulinės struktūros (išsamiai apžvelgta Desmet ir Ishii) (Desmet and Ishii, 2012), Pavyzdžiui, TLR7 ekspresija pasireiškia daugiausia žmogaus plazmocitoidinėse DCs ir B ląstelėse, kai TLR8 yra ekspresuojamas monocituose, makrofaguose ir įprastose DCs, bet ne plazmocitoidinėse DCs. Kadangi DC subpopuliacijos turi skirtingas privilegijuotas lokalizacijos vietas, kurios gali būti paveiktos pacientų uždegiminės būklės (Hartmann ir kt., 2003, 2006; Naik ir kt., 2006; Wollenberg ir kt., 2002), injekavimo kelias taip pat gali lemti vakcinavimo efektyvumą. Perkėlimas eksperimentinių rezultatų iš gyvūnų modelių žmonėms reikalauja naudojamų injekavimo kelių aptarimo ir dėl to susidariusių specifinių sunkumų ar pranašumų tyrimo.

Klinikiniai eksperimentai su mRNR vakcinomis

Klinikiniai bandymai, naudojantys pacientams tiesiogines mRNR injekcijas vietoj DCs apdorojimo in vitro ir paruoštų ląstelių suleidimo, buvo pradėti prieš 10 metų. Pirmame bandyme dalyvavo 15 pacientų su III arba IV stadijos melanoma (Weide ir kt., 2008). cDNR biblioteka buvo parengta iš pacientų metastazių ir transkribuota į mRNR biblioteką. Tada autologinė mRNR biblioteka buvo suleista pacientams su granuliocitų-makrofagų kolonijas stimuliuojančiu faktoriumi (GM-CSF) kaip adjuvantu. Pakartotinos injekcijos mRNR bibliotekos vakcinų buvo saugios. Imunoanalizė, suvaržyta technologinių sunkumų išmatuojant imuninį atsaką prieš netiksliai apibrėžtus taikinius, parodė, kad humoralinis atsakas susidarė 4 pacientuose ir juose galėjo būti trumpalaikis CD4+ ir CD8+ T ląstelių padidėjimas. Tikslinis atsakas nebuvo stebimas, bet du pacientai turėjo mišrų atsaką ir palanki klinikinė eiga buvo stebima 5 pacientuose. 

Kitame bandyme 21 pacientui su metastazuojančia melanoma buvo suleista į odą protaminu stabilizuota mRNR, koduojanti Melan-A, tirozinazę, gp100, Mage-A1, Mage-A3 ir surviviną, su GM-CSF kaip adjuvantu (Weide ir kt., 2009). 10 pacientų kartu su vakcina buvo suleidžiama moliuskų (angl. keyhole limpet) hemocianino (KLH). Nebuvo stebima didesnių nei II laipsnio nepalankių poveikių. Du iš keturių imunologiškai įvertinamų pacientų parodė antigenui specifinį T ląstelių atsaką. Įdomiausia, ir KLH gavusiuose pacientuose, buvo stebimas sumažėjimas Foxp3+/CD4+ T-reg ląstelių, o mieloidinių supresorinių ląstelių (CD11b+HLA-DRlo monocitų) sumažėjo negavusiuose KLH pacientuose. Vienas iš 7 pacientų su įvertinta liga turėjo dalinį plaučių metastazių atsaką po 12 vakcinavimų. Histopatologiškai patvirtintos kaulų metastazės, nustatytos šiame paciente 16 mėnesių po vakcinacijos pradžios, buvo chirurginiu būdu pašalintos ir šis pacientas daugiau neatkrito.

Trisdešimt pacientų su IV stadijos inkstų ląstelių vėžiu buvo paveikti plika mRNR, koduojančia su vėžiu susijusius antigenus muciną 1 (MUC1), CEA, žmogaus epidermio augimo faktoriaus receptorių 2 (Her-2/neu), telomerazę, surviviną ir su melanoma susijusį antigeną 1 (MAGE-A1) kartu su GM-CSF kaip adjuvantu (Rittig ir kt., 2011). Pirmi 14 pacientų gavo mažiau intensyvų vakcinavimo režimą nei likę 16 pacientų. Vėliau abi grupės gavo buvo vakcinuojamos kas mėnesį ir abi grupės vakcinacijas toleravo gerai. Imunologiškai įvertinta medžiaga buvo gauta iš 17 pacientų, iš kurių 12 turėjo imuninį atsaką. Šeši pacientai pirmoje grupėje ir devyni antroje grupėje turėjo stabilią neprogresuojančią ligą, kuri tęsėsi ilgiau nei 3 mėnesius; vienas pacientas pirmoje grupėje turėjo patvirtintą dalinį atsaką su kaklo ir tarpuplaučio limfmazgių sumažėjimu. Vienas pacientas antroje grupėje, kuriam reikėjo atlikti pilvo paracentezę, kas antrą dieną rodė mažėjimą paracentezės dažnio kartu su vėžio žymens CA-125 mažėjimu ir nykimu pilvinės vėžio dalies. Galiausiai šis pacientas nebeturėjo paracentezės daugiau nei 3 mėnesius.

Pirmi klinikiniai bandymai su adjuvantinėmis RNActive® vakcinomis (CureVac GmbH, Tübingen, Germany) buvo atlikti pacientams su pažengusia operavimui atsparia prostatos karcinoma ir IIIB/IV stadijos nesmulkialąsčiu plaučių vėžiu (NSCLC), kurie buvo stabilūs po pirmo chemoterapijos poveikio platina ar chemoradiacijos. Abu tyrimai patvirtino, jog RNAktyvių vakcinų naudojimas žmonėms yra saugus. Tyrimui I/IIa fazės pacientų su prostatos vėžiu buvo pasirinkti keturi su prostatos vėžiu susiję antigenai, prostatos kamieninių ląstelių antigenas, prostatai specifinis membranos antigenas ir šeši prostatos 1 transmembraniniai epitelio antigenai, ir pažymėti CV9103 (Kübler ir kt., 2011). NSCLC antigenų kokteilis CV9201 buvo sudarytas iš 5 su vėžiu susijusių antigenų: MAGE-C1, MAGE-C2, NY-ESO-1, survivino ir 5T4 (Sebastian ir kt., 2011, 2012).

I/IIa fazės prostatos-karcinomos tyrimas su CV9103 parodė nelauktai aukštą antigenui specifinių T ląstelių lygį po 5 vakcinacijų į odą, suleistų per 6 mėnesius maždaug 80 % imunologiškai įvertintų pacientų su prostatos karcinoma nepriklausomai nuo jų HLA fono (Kübler ir kt., 2011). Kiti tyrėjai taip pat nurodo mRNR vakcinavimą kaip metodą apeiti HLA sukeliamus apribojimus pacientuose su vėžiu (Van Nuffel ir kt., 2012c). Antigenui specifinių T-ląstelių imuninis atsakas buvo nustatytas prieš visus antigenus, nepriklausomai nuo jų lokalizacijos ląstelėje. Mažiau aiškūs rezultatai buvo stebimi su antigenui nespecifinėmis B ląstelėmis, kurių padaugėjo, ir NK ląstelėmis, kurios rodė šiek tiek padidėjusį aktyvumą. Dauguma pacientų, turinčių antigenui specifinį imuninį atsaką, reagavo daugiau nei su vienu antigenu. Tai fenomenas, neseniai susietas su padidėjusiu išgyvenamumu peptidinių vakcinų tyrime pacientuose su inkstų ląstelių karcinoma (Walter ir kt., 2012). Kadangi šio tyrimo tikslas nebuvo įvertinti klinikinį efektyvumą, individualūs pacientai parodė įdomią klinikinę eigą, kuri patvirtino klinikinę sėkmę. Vakcinuotųjų bendras išgyvenamumas ir koreliacija su imuniniu atsaku šiuo metu yra analizuojama (ruošiamas straipsnis).

Remiantis pradiniais rezultatais, CV9104 (patobulintos CV9103 versijos) vakcinos klinikinio efektyvumo įvertinimui sisteminiu metodu toliau yra atliekamas kontroliuojamas IIb fazės tyrimas, į kurį buvo įtraukti pacientai su operacijai atsparia prostatos karcinoma ir asimptominėmis ar minimaliai simptominėmis metastazėmis. Tyrime yra atliekama dažnesnė vakcinacija sukėlimo fazėje, po kurios seka pailgintais intervalais atliekama palaikančioji vakcinacija. Pradinis šio tyrimo su apie 180 pacientų iš devynių Europos šalių vertinimo kriterijus bus bendras išgyvenamumas. Papildomai eilėje antrinių vertinimo taškų bus tiriami poveikio, susijusio su pagerėjusiu išgyvenamumu ir tolesnių terapijų įtakos, mechanizmai (ClinicalTrials.gov identifier: NCT01817738).

Panašiai prostatos karcinomos tyrimui, vakcinacijų skaičius I/IIa fazės pacientų su NSCLC tyrime buvo apribotas iki penkių imunizacijų į odą, bet šių pacientų daug sunkesnė liga reikalavo intensyvesnio vakcinavimo grafiko. Panašiai kaip CV9103, NSCLC kokteilis CV9201 pasirodė tinkamu ir saugiu produktu. Antigenui specifinis humoralinis ir ląstelinis imuninis atsakas buvo nustatytas maždaug dviejuose trečdaliuose vakcinuotų pacientų. Daugiau nei pusei pacientų buvo stebimas reikšmingas pregerminalinio centro B ląstelių padidėjimas vertinant bent pagal du faktorius ir susijęs su bendru CD4+ efektorinių T ląstelių padidėjimu vakcinavimo metu. Kartu daugiau nei 80 % NSCLC pacientų turėjo išmatuojamą antigenui specifinį imuninį atsaką ar padidėjimą germinalinių centrų B ląstelių, nepaisant stipraus, prieš tai atlikto gydymo chemoterapija su platina (Sebastian, ruošiamas straipsnis). Remiantis šiais rezultatais, buvo pradėtas Ib fazės tyrimas pacientuose su metastazuojančia NSCLC įvertinimui numatomo sinergistinio poveikio tarp vakcinavimo ir radiacijos (ClinicalTrials.gov identifier: NCT01915524).

Naujas taikymas: genų terapija

Wolff ir kolegos parodė, kad mRNR gali būti naudojama svetimų baltymų ekspresijai in vivo (Wolff ir kt., 1990). Tai, kad RNR replikonai gali patys pasidauginti ir padidinti baltymų ekspresiją, parodyta seniau (Johanning ir kt., 1995; Zhou ir kt., 1994). Labai padidinta baltymų ekspresija gali sukelti imunogeniškai pražūtingą ląstelių žūtį. Tai yra problema, kuri iškyla dėl baltymų, atpažįstančių dvigrandę RNR, tokių kaip dvigrandės PKR (dsPKR), suaktyvinimo (Berglund ir kt., 1998; Diebold ir kt., 2009). Tokia stipri baltymų ekspresija gali padidinti vakcinų potencialą, bet aiškiai bus nepageidaujama dėl neimunogeninių baltymų ekspresijos. Žinduolių mRNR turi ne tik nukleotidus A, G, C, U, bet taip pat modifikuotus nukleozidus, tokius kaip 5-metilcitidiną ir N6 metiladenoziną (Kariko and Weissman, 2007). Šie, kaip ir kiti žinomi modifikuoti nukleozidai, pvz., pseudouridinas (ψ), sumažina imuninės sistemos aktyvavimą per RNR receptorius, tokius kaip TLR3, TLR7, TLR8 ir dsPKR (Kariko ir Weissman, 2007). Bakterijos neturi tokių modifikuotų nukleozidų, bet jų yra gausu virusuose, kur jie dalyvauja virusų apsigynime nuo imuninės sistemos (Kariko ir kt., 2005, 2008; Koski ir kt., 2004). Nukleozidų modifikacijos gali apriboti 2’-5’-oligoadenilato sintetazės aktyvumą ir lėtą skaldymą su RNaze L. PKR aktyvavimas gali būti sumažintas įsijungus pseudouridinui (ψ) į mRNR, kas sukelia sustiprintą baltymų ekspresiją galimai dėl sumažėjusio imuninių stimuliatorių poveikio į baltymų transliaciją (Anderson ir kt., 2010).

Todėl pseudouridinas (ψ) buvo naudojamas ruošiant mRNR, koduojančią eritropoetiną. Eritropoetiną koduojančio pseudouridino (ψ) mRNR injekcijos pelėms į pilvo ertmę gerokai padidina retikuliocitų skaičių ir hematokritą (Kariko ir kt., 2012). Po pakartotinų eritropoetino pseudouridino (ψ) mRNR injekcijų nenustatomas padidėjęs citokinų kiekis ir naujai susidarę antikūnai prieš eritropoetiną. Pradiniuose tyrimuose buvo nustatytas padidėjęs eritropoetino lygis po vienos injekcijos į makakos pilvo ertmę. Tačiau esminė CureVac analizė parodė, kad sustiprintos, sukonstruotų sekų mRNR, naudojamos RNAktyviose vakcinose, nesukelia tinkamo imuninio aktyvavimo, kai nėra mRNR komplekso su protaminu (nepaskelbti tyrimai). Paruošta koduojanti eritropoetiną mRNR sukelia aiškų, biologiškai tinkamą retikuliocitų padaugėjimą pelėse po vienos injekcijos į raumenis. Atitinkamai pseudouridiną (ψ)-turinti mRNR nebuvo efektyvesnė retikuliocitų padaugėjime (nepaskelbti tyrimai). Kiti mokslininkai 2-tiouridinu ir 5-metil citidinu pakeitė santykinai nedidelę dalį uridino ir citidino, kas lėmė sinergistinį mRNR rišimosi prie struktūras atpažįstančių receptorių ir imunogeninių citokinų atpalaidavimo sumažėjimą (Kormann ir kt., 2011). Vienkartinė tokios modifikuotos eritropoetino mRNR injekcija į raumenis po 28 dienų pakėlė hematokritą nuo 51,5 % iki 64,2 %. Svarbiausia, autoriai taip pat parodė, kad jie išsaugojo letalų paveldimą pelių linijos fenotipą, sąlygojamą surfaktantinio baltymo B (SP-B) netekimo, įvesdami modifikuotą SP-B mRNR kaip aerozolį. Visai neseniai pasirodžiusiame straipsnyje nurodoma, jog pelių miokardo infarkto modelyje žmogaus kraujagyslių endotelio augimo faktorių A (VEGF-A) koduojančios sintetinės modifikuotos mRNR kartu su lipofektaminu kaip pernešimo medžiaga suleidimas į širdies raumenį padidino endogeninių širdies pirmtakų funkcionalumą ir ilgaamžiškumą, jiems pasidauginant ir nukreiptai diferencijuojant (Zangi ir kt., 2013). VEGF-A, paruošta kaip nemodifikuota mRNR, buvo neefektyvi, o VEGF-A, paruošta kaip DNR vektorius, turėjo net žalingą poveikį kai kuriems parodymams dėl galbūt užsitęsusios VEGF-A ekspresijos. Priešingai, VEGF-A modRNR pademonstravo ritmingą širdies ekspresijos profilį in vivo su greita po kelių valandų baltymų ekspresavimo pradžia, o pikas po 18 h, kas gali būti idealu pamėgdžiojant dažnai trumpalaikę parakrininio signalo prigimtį. Liuciferazės modRNR ekspresijos in vivo profilis akivaizdžiai labai panašus į CureVac koduojamos liuciferazės (žiūrėti aukščiau) po tiesioginio suleidimo be transportuojančios medžiagos į pelių odą (2 pav. (c)), o in vitro VEGF-A modRNR ekspresija pasirodė trumpesnė nei liuciferazės ekspresija in vitro su sustiprinta sukonstruota mRNR (2 pav. (b)) (Zangi ir kt., 2013). Tai gali rodyti, jog sukonstruotų sekų, padidintos ekspresijos mRNR, paruošta iš nemodifikuotų nukleotidų, gali atitikti ar net pranokti sintetinę modifikuotą mRNR kaip baltymų pristatymo sistema.

„Ethris“ ar „ModeRNA“ kompanijų komerciškai parduodamų modifikuotų mRNR panaudojimas taip pat palengvina tolesnius tyrimus. Warren su kolegomis sukūrė daugiagalių kamieninių ląstelių indukavimo, pakartotinai transfekuojant ląsteles su modifikuotų mRNR kokteiliu, protokolą. Šį kokteilį sudaro keturi kanoniniai kamieninių ląstelių transkripcijos faktoriai (Yamanaka faktoriai) (Takahashi ir kt., 2007; Takahashi ir Yamanaka, 2006): KLF4, c-MYC, OCT4 ir SOX2, taip pat modRNR, koduojanti LIN28 (KMOSL) (Warren ir kt., 2010). Jau anksčiau parodyta, jog pastaroji palengvina pakartotiną užprogramavimą (Hanna ir kt., 2009; Yu ir kt., 2007). RNR indukuotos daugiagalės kamieninės ląstelės (RiPSCs) gali susidaryti iš daugelio nepriklausomų šaltinių ir visos rodo pastovią, su daugiapotenciškumu susijusių transkriptų OCT4, SOX2, NANOG ir hTERT ekspresiją. Kadangi modRNRs su labai dideliu efektyvumu gamina iPSCs, šie rezultatai pacientams gali būti pradinis specifinės terapijos taškas. Skirtingai šiems darbams, taip pat buvo parodyta, kad penkios nuoseklios transfekcijos in vitro pagamintos, nemodifikuotos mRNR, koduojančios transkripcijos faktorius Oct4, Lin28, Sox2 ir Nanog, į žmogaus apyvarpės fibroblastus sukėlė pastovią baltymų ekspresiją, dėl kurios formavosi indukuotų daugiagalių ląstelių kolonijos, ekspresuojančios šarminę fosfatazę ir kelis embrioninių kamieninių ląstelių žymenis (Yakubov ir kt., 2010). Dar naujesnis straipsnis net nurodo, jog uždegiminių kelių aktyvavimas, ypač TLR3 (dvispiralės RNR receptorius), yra reikalingas efektyviam branduoliniam perprogramavimui ir daugiagališkumo sukėlimui (Lee ir kt., 2012). Taigi indukuojant RiPSCs nemodifikuota mRNR gali būti alternatyva modifikuotai mRNR.

Terapijos su RiPSCs gali reikalauti prisitaikymo prie įvairių ląstelių tipų (Warren ir kt., 2010). mRNR formato paslankumas ir laikina baltymų ekspresija leidžia eksperimentiškai aktyvuoti vystymuisi svarbias transkripcines programas, ekspresuojant tinkamus transkripcijos faktorius, kontroliuojant juos laike ir stadijai specifinėje sekoje, ir taip nukreipiant RiPSC ląsteles diferencijuotis į įvairius tipus (Mandal and Rossi, 2013).

Išvados

mRNR panaudojimas biologiškai aktyvių baltymų ekspresijai turi principinius pranašumus prieš DNR panaudojimą:

  1. pašalinta net minimali genominės integracijos rizika; 
  2. mRNR turi pereiti tik vieną ląstelinę membraną, kad taptų aktyvi citoplazmoje; 
  3. nereikalauja promotoriaus; 
  4. mRNR taip pat yra aktyvi nesidalijančiose ląstelėse; 
  5. mRNR konstruktai gali būti pagaminami taip, jog sumažintų ir net visai pašalintų vektoriaus sukeliamą imunogeniškumą, o tai leidžia atlikti pakartotinas injekcijas. 

Su mRNR vakcinomis gauti įspūdingi ikiklinikiniai rezultatai tokiose skirtingose srityse kaip onkologija, infekcinės ligos ir alergologija. Pirmi klinikiniai tyrimai onkologijoje suteikė galimybę perkelti ikiklinikinius rezultatus žmogui. mRNR vakcinų gamyba yra nebrangi, gamybos procesas labai paslankus ir lengvai padidinamas. Tai revoliucinė, viską pakeičianti technologija vakcinologijoje. Panašūs įspūdingi rezultatai gauti kamieninių ląstelių tyrimuose ir genų defektų sukeltose ligose. Panašu, jog mRNR technologijos šiandien pasiekė lygį, kai tampa įmanomos mRNR pagrindo baltymų ar genų pakaitinės terapijos. Taigi greičiau mRNR nei DNR, kuri dešimtmečius buvo laikoma favorite, bus naujos nukleotidinių vaistų klasės pagrindas. mRNR panaudojimas gali būti revoliucijos pradžia medicinoje.

Literatūros sąrašas

[1] Anderson, B., Muramatsu, H., Nallagatla, S., Bevilacqua, P., Sansing, L., Weissman, D. ir kt., (2010) Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation. Nucleic Acids Res 38: 5884–5892.
[2 ]Anraku, I., Harvey, T., Linedale, R., Gardner, J., Harrich, D., Suhrbier, A. ir kt., (2002) Kunjin virus replicon vaccine vectors induce protective CD8+ T-cell immunity. J Virol 76: 3791–3799.
[3] Aoshi, T., Koyama, S., Kobiyama, K., Akira, S. and Ishii, K.J. (2011) Innate and adaptive immune responses to viral infection and vaccination. Curr Opin Virol 1: 226–232.
[4] Bagarazzi, M., Yan, J., Morrow, M., Shen, X., Parker, R., Lee, J. ir kt., (2012) Immunotherapy against PV16/18 generates potent TH1 and cytotoxic cellular immune responses. Sci Transl Med 4: 155ra138.
[5] Banerjee, A. (1980) 5′-terminal cap structure in eucaryotic messenger ribonucleic acids. Microbiol Rev 44: 175–205.
[6] Bargou, R., Leo, E., Zugmaier, G., Klinger, M., Goebeler, M., Knop, S. ir kt., (2008) Tumor regression in cancer patients by very low doses of a T cell-engaging antibody. Science 321: 974–977.
[7] Bauer, R., Scheiblhofer, S., Kern, K., Gruber, C., Stepanoska, T., Thalhamer, T. ir kt., (2006) Generation of hypoallergenic DNA vaccines by forced ubiquitination: preventive and therapeutic effects in a mouse model of allergy. J Allergy Clin Immunol 118: 269–276.
[8] Bedikian, A., Richards, J., Kharkevitch, D., Atkins, M., Whitman, E. and Gonzalez, R. (2010) A phase 2 study of high-dose Allovectin-7 in patients with advanced metastatic melanoma. Melanoma Res 20: 218–226.
[9] Bendtzen, K. (2012) Anti-TNF-alpha biotherapies: perspectives for evidence-based personalized medicine. Immunotherapy 4: 1167–1179.
[10] Benteyn, D., Van Nuffel, A., Wilgenhof, S., Corthals, J., Heirman, C., Neyns, B. ir kt., (2013) Characterization of CD8+ T-cell responses in the peripheral blood and skin injection sites of melanoma patients treated with mRNA electroporated autologous dendritic cells (TriMixDC-MEL). Biomed Res Int 2013: 976383.
[11] Berglund, P., Fleeton, M., Smerdou, C. and Liljeström, P. (1999) Immunization with recombinant Semliki Forest virus induces protection against influenza challenge in mice. Vaccine 17: 497–507.
[12] Berglund, P., Smerdou, C., Fleeton, M., Tubulekas, I. and Liljeström, P. (1998) Enhancing immune responses using suicidal DNA vaccines. Nat Biotechnol 16: 562–565.
[13] Bernstein, D., Cardin, R., Bravo, F., Earwood, J., Clark, J., Li, Y. ir kt., (2012) Topical SMIP-7.7, a tolllike receptor 7 agonist, protects against genital herpes simplex virus-2 disease in the guinea pig model of genital herpes. Antivir Chem Chemother 12 December (Epub ahead of print).
[14] Biankin, A., Waddell, N., Kassahn, K., Gingras, M., Muthuswamy, L., Johns, A. ir kt., (2012) Pancreatic cancer genomes reveal aberrations in axon guidance pathway genes. Nature 491: 399–405.
[15] Boczkowski, D., Nair, S., Snyder, D. and Gilboa, E. (1996) Dendritic cells pulsed with RNA are potent antigen-presenting cells in vitro and in vivo. J Exp Med 184: 465–472.
[16] Bonehill, A., Heirman, C., Tuyaerts, S., Michiels, A., Zhang, Y., van der Bruggen, P. ir kt., (2003) Efficient presentation of known HLA class II-restricted MAGE-A3 epitopes by dendritic cells electroporated with messenger RNA encoding an invariant chain with genetic exchange of class II-associated invariant chain peptide. Cancer Res 63: 5587–5594.
[17] Bonehill, A., Tuyaerts, S., Van Nuffel, A., Heirman, C., Bos, T., Fostier, K. ir kt., (2008) Enhancing the T-cell stimulatory capacity of human dendritic cells by co-electroporation with CD40L, CD70 and constitutively active TLR4 encoding mRNA. Mol Ther 16: 1170–1180.
[18] Breckpot, K., Dullaers, M., Bonehill, A., van Meirvenne, S., Heirman, C., de Greef, C. ir kt., (2003) Lentivirally transduced dendritic cells as a tool for cancer immunotherapy. J Gene Med 5: 654–667.
[19] Breckpot, K., Heirman, C., Neyns, B. and Thielemans, K. (2004) Exploiting dendritic cells for cancer immunotherapy: genetic modification of dendritic cells. J Gene Med 6: 1175–1188.
[20] Castle, J., Kreiter, S., Diekmann, J., Lower, M., van de, Roemer, N., de Graaf, J. ir kt., (2012) Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer Res 72:1081–1091.
[21] Christensen, C. (1997) The innovator’s dilemma: when new technologies cause great firms to fail (management of innovation and change). Watertown, MA: Harvard Business Review Press.
[22] Conry, R., LoBuglio, A., Wright, M., Sumerel, L., Pike, M., Johanning, F. ir kt., (1995) Characterization of a messenger RNA polynucleotide vaccine vector. Cancer Res 55: 1397–1400.
[23] Davis, B., Chang, G., Cropp, B., Roehrig, J., Martin, D., Mitchell, C. ir kt., (2001) West Nile virus recombinant DNA vaccine protects mouse and horse from virus challenge and expresses in vitro a noninfectious recombinant antigen that can be used in enzyme-linked immunosorbent assays. J Virol 75:4040–4047.
[24] Day, K., Sweeny, L., Kulbersh, B., Zinn, K. and Rosenthal, E. (2013) Preclinical comparison of near-infrared-labeled cetuximab and panitumumab for optical imaging of head and neck squamous cell carcinoma. Mol Imaging Biol 29 May (Epub ahead of print).
[25] Desmet, C. and Ishii, K. (2012) Nucleic acid sensing at the interface between innate and adaptive immunity in vaccination. Nat Rev Immunol 12: 479–491.
[26] Diamond, M., Kinder, M., Matsushita, H., Mashayekhi, M., Dunn, G., Archambault, J. ir kt., (2011) Type I interferon is selectively required by dendritic cells for immune rejection of tumors. J Exp Med 208: 1989–2003.
[27] Diebold, S., Schulz, O., Alexopoulou, L., Leitner, W., Flavell, R. and Reis e Sousa, C. (2009) Role of TLR3 in the immunogenicity of replicon plasmid-based vaccines. Gene Ther 16: 359–366.
[28] Diken, M., Kreiter, S., Selmi, A., Britten, C., Huber, C., Tureci, O. ir kt., (2011) Selective uptake of naked vaccine RNA by dendritic cells is driven by macropinocytosis and abrogated upon DC maturation. Gene Ther 18: 702–708.
[29] Diken, M., Kreiter, S., Selmi, A., Tureci, O. and Sahin, U. (2013) Antitumor vaccination with synthetic mRNA: strategies for in vitro and in vivo preclinical studies. Methods Mol Biol 969: 235–246.
[30] Dubensky, T., Jr, Driver, D., Polo, J., Belli, B., Latham, E., Ibanez, C. ir kt., (1996) Sindbis virus DNA-based expression vectors: utility for in vitro and in vivo gene transfer. J Virol 70: 508–519.
[31] Dunn, G., Old, L. and Schreiber, R. (2004) The three Es of cancer immunoediting. Annu Rev Immunol 22: 329–360.
[32] Ferraro, B., Talbott, K., Balakrishnan, A., Cisper, N., Morrow, M., Hutnick, N. ir kt., (2013) Inducing humoral and cellular responses to multiple sporozoite and liver stage malaria antigens using pDNA. Infect Immun 81: 3709–3720.
[33] Finnegan, G. (2012) Europe risks ‘vaccine fatigue’. Vaccines today 8 October.
[34] Fleeton, M., Chen, M., Berglund, P., Rhodes, G., Parker, S., Murphy, M. ir kt., (2001) Self-replicative RNA vaccines elicit protection against influenza A virus, respiratory syncytial virus, and a tickborne encephalitis virus. J Infect Dis 183: 1395–1398.
[35] Fleeton, M., Liljeström, P., Sheahan, B. and Atkins, G. (2000) Recombinant Semliki Forest virus particles expressing louping ill virus antigens induce a better protective response than plasmid-based DNA vaccines or an inactivated whole particle vaccine. J Gen Virol 81: 749–758.
[36] Fotin-Mleczek, M., Duchardt, K., Lorenz, C., Pfeiffer, R., Ojkic-Zrna, S., Probst, J. ir kt., (2011) Messenger RNA-based vaccines with dual activity induce balanced TLR-7 dependent adaptive immune responses and provide antitumor activity. J Immunother 34: 1–15.
[37] Fotin-Mleczek, M., Zanzinger, K., Heidenreich, R., Lorenz, C., Thess, A., Duchardt, K. ir kt., (2012) Highly potent mRNA based cancer vaccines represent an attractive platform for combination therapies supporting an improved therapeutic effect. J Gene Med 14: 428–439.
[38] Garver, K., LaPatra, S. and Kurath, G. (2005) Efficacy of an infectious hematopoietic necrosis (IHN) virus DNA vaccine in Chinook Oncorhynchus tshawytscha and sockeye O. nerka salmon. Dis Aquat Organ 64: 13–22.
[39] Geall, A., Mandl, C. and Ulmer, J. (2013) RNA: The new revolution in nucleic acid vaccines. Semin Immunol 25: 152–159.
[40] Geall, A., Verma, A., Otten, G., Shaw, C., Hekele, A., Banerjee, K. ir kt., (2012) Nonviral delivery of selfamplifying RNA vaccines. Proc Natl Acad Sci U S A 109: 14604–14609.
[41] Gilboa, E. (2007) DC-based cancer vaccines. J Clin Invest 117: 1195–1203.
[42] Gilboa, E. (2012) mRNA leapfrogs DNA to show promise for therapeutic gene transfer. Mol Ther 20: 694–695.
[43] Gilboa, E. and Vieweg, J. (2004) Cancer immunotherapy with mRNA-transfected dendritic cells. Immunol Rev 199: 251–263.
[44] Gould, H. and Sutton, B. (2008) IgE in allergy and asthma today. Nat Rev Immunol 8: 205–217.
[45] Grosenbaugh, D., Leard, A., Bergman, P., Klein, M., Meleo, K., Susaneck, S. ir kt., (2011) Safety and efficacy of a xenogeneic DNA vaccine encoding for human tyrosinase as adjunctive treatment for oral malignant melanoma in dogs following surgical excision of the primary tumor. Am J Vet Res 72: 1631–1638.
[46] Gulley, J. and Drake, C. (2011) Immunotherapy for prostate cancer: recent advances, lessons learned, and areas for further research. Clin Cancer Res 17: 3884–3891.
[47] Han, S., Asoyan, A., Rabenstein, H., Nakano, N. and Obst, R. (2010) Role of antigen persistence and dose for CD4+ T-cell exhaustion and recovery. Proc Natl Acad Sci U S A 107: 20453–20458.
[48] Hanna, J., Saha, K., Pando, B., van Zon, J., Lengner, C., Creyghton, M. ir kt., (2009) Direct cell reprogramming is a stochastic process amenable to acceleration. Nature 462: 595–601.
[49] Hariharan, M., Driver, D., Townsend, K., Brumm, D., Polo, J., Belli, B. ir kt., (1998) DNA immunization against herpes simplex virus: enhanced efficacy using a Sindbis virus-based vector. J Virol 72: 950–958.
[50] Hartmann, E., Graefe, H., Hopert, A., Pries, R., Rothenfusser, S., Poeck, H. ir kt., (2006) Analysis of plasmacytoid and myeloid dendritic cells in nasal epithelium. Clin Vaccine Immunol 13: 1278–1286.
[51] Hartmann, E., Wollenberg, B., Rothenfusser, S., Wagner, M., Wellisch, D., Mack, B. ir kt., (2003). Identification and functional analysis of tumorinfiltrating plasmacytoid dendritic cells in head and neck cancer. Cancer Res 63: 6478–6487.
[52] Hekele, A., Bertholet, S., Archer, J., Gibson, D., Palladino, G., Brito, L. ir kt., (2013) Rapidly produced SAMH vaccine against H7N9 influenza is immunogenic in mice. Emerging Microbes and Infections 2: e52.
[53] Henrickson, S., Mempel, T., Mazo, I., Liu, B., Artyomov, M., Zheng, H. ir kt., (2008) T cell sensing of antigen dose governs interactive behavior with dendritic cells and sets a threshold for T cell activation. Nat Immunol 9: 282–291.
[54] Hoerr, I., Obst, R., Rammensee, H. and Jung, G. (2000) In vivo application of RNA leads to induction of specific cytotoxic T lymphocytes and antibodies. Eur J Immunol 30: 1–7.
[55] Holtkamp, S., Kreiter, S., Selmi, A., Simon, P., Koslowski, M., Huber, C. ir kt., (2006) Modification of antigen-encoding RNA increases stability, translational efficacy, and T-cell stimulatory capacity of dendritic cells. Blood 108: 4009–4017.
[56] Iavarone, C., Ramsauer, K., Kubarenko, A., Debasitis, J., Leykin, I., Weber, A. ir kt., (2011) A point mutation in the amino terminus of TLR7 abolishes signaling without affecting ligand binding. J Immunol 186: 4213–4222.
[57] Johanning, F., Conry, R., LoBuglio, A., Wright, M., Sumerel, L., Pike, M. ir kt., (1995) A Sindbis virus mRNA polynucleotide vector achieves prolonged and high level heterologous gene expression in vivo. Nucleic Acids Res 23: 1495–1501.
[58] Johansson, D., Ljungberg, K., Kakoulidou, M. and Liljeström, P. (2012) Intradermal electroporation of naked replicon RNA elicits strong immune responses. PLoS One 7: e29732.
[59] Julkunen, I., Sareneva, T., Pirhonen, J., Ronni, T., Melen, K. and Matikainen, S. (2001) Molecular
[60] pathogenesis of influenza A virus infection and virus-induced regulation of cytokine gene expression. Cytokine Growth Factor Rev 12: 171–180.
[61] Kallen, K., Heidenreich, R., Schnee, M., Petsch, B., Schlake, T., Thess, A. ir kt., (2013) A novel, disruptive vaccination technology: self-adjuvanted RNActive® vaccines. Hum Vaccin Immunother 9: 2263–2276.
[62] Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H. and Weissman, D. (2005) Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity 23:165–175.
[63] Kariko, K., Muramatsu, H., Keller, J. and Weissman, D. (2012) Increased erythropoiesis in mice injected with submicrogram quantities of pseudouridinecontaining mRNA encoding erythropoietin. Mol Ther 20: 948–953.
[64] Kariko, K., Muramatsu, H., Welsh, F., Ludwig, J., Kato, H., Akira, S. ir kt., (2008) Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Mol Ther 16: 1833–1840.
[65] Kariko, K. and Weissman, D. (2007) Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development. Curr Opin Drug Discov Devel 10: 523–532.
[66] Ketterer, T., von der Mülbe, F., Reidel, L. and Mutzke, T. (2008) Method for purifying RNA on a preparative scale by means of HPLC. Patent WO2008077592.
[67] Kharfan-Dabaja, M., Boeckh, M., Wilck, M., Langston, A., Chu, A., Wloch, M. ir kt., (2012) A novel therapeutic cytomegalovirus DNA vaccine in allogeneic haemopoietic stem-cell transplantation: a randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 2 trial. Lancet Infect Dis 12: 290–299.
[68] Killela, P., Reitman, Z., Jiao, Y., Bettegowda, C., Agrawal, N., Diaz, L., Jr ir kt., (2013) TERT promoter mutations occur frequently in gliomas and a subset of tumors derived from cells with low rates of self-renewal. Proc Natl Acad Sci U S A 110: 6021–6026.
[69] Kirman, J., Turon, T., Su, H., Li, A., Kraus, C., Polo, J. ir kt., (2003) Enhanced immunogenicity to Mycobacterium tuberculosis by vaccination with an alphavirus plasmid replicon expressing antigen 85A. Infect Immun 71: 575–579.
[70] Kormann, M., Hasenpusch, G., Aneja, M., Nica, G., Flemmer, A., Herber-Jonat, S. ir kt., (2011) Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nat Biotechnol 29: 154–157.
[71] Koski, G., Kariko, K., Xu, S., Weissman, D., Cohen, P. and Czerniecki, B. (2004) Cutting edge: innate immune system discriminates between RNA containing bacterial versus eukaryotic structural features that prime for high-level IL-12 secretion by dendritic cells. J Immunol 172: 3989–3993.
[72] Kreiter, S., Castle, J., Tureci, O. and Sahin, U. (2012) Targeting the tumor mutanome for personalized vaccination therapy. Oncoimmunology 1: 768–769.
[73] Kreiter, S., Diken, M., Selmi, A., Tureci, O. and Sahin, U. (2011) Tumor vaccination using Messenger RNA: prospects of a future therapy. Curr Opin Immunol 23: 399–406.
[74] Kreiter, S., Selmi, A., Diken, M., Koslowski, M., Britten, C., Huber, C. ir kt., (2010) Intranodal vaccination with naked antigen-encoding RNA elicits potent prophylactic and therapeutic antitumoral immunity. Cancer Res 70: 9031–9040.
[75] Kreiter, S., Selmi, A., Diken, M., Sebastian, M., Osterloh, P., Schild, H. ir kt., (2008) Increased antigen presentation efficiency by coupling antigens to MHC class I trafficking signals. J Immunol 180: 309–318.
[76] Kübler, H., Maurer, T., Stenzl, A., Feyerabend, S., Steiner, U., Schostak, M. ir kt., (2011) Final analysis of a phase I/IIa study with CV9103, an intradermally administered prostate cancer immunotherapy based on self-adjuvanted mRNA. J Clin Oncol 29(Suppl.): abstract 4535.
[77] Kuhn, A., Diken, M., Kreiter, S., Selmi, A., Kowalska, J., Jemielity, J. ir kt., (2010) Phosphorothioate cap analogs increase stability and translational efficiency of RNA vaccines in immature dendritic cells and induce superior immune responses in vivo. Gene Ther 17: 961–971.
[78] Kurath, G., Garver, K., Corbeil, S., Elliott, D., Anderson, E. and LaPatra, S. (2006) Protective immunity and lack of histopathological damage two years after DNA vaccination against infectious hematopoietic necrosis virus in trout. Vaccine 24: 345–354.
[79] Lee, J., Sayed, N., Hunter, A., Au, K., Wong, W., Mocarski, E. ir kt., (2012) Activation of innate immunity is required for efficient nuclear reprogramming. Cell 151: 547–558.
[80] Leitner, W., Hwang, L., deVeer, M., Zhou, A., Silverman, R., Williams, B. ir kt., (2003) Alphavirusbased DNA vaccine breaks immunological tolerance by activating innate antiviral pathways. Nat Med 9: 33–39.
[81] Leitner, W., Ying, H., Driver, D., Dubensky, T. and Restifo, N. (2000) Enhancement of tumor-specific immune response with plasmid DNA replicon vectors. Cancer Res 60: 51–55.
[82] Lindsay, C., Roxburgh, P. and Graham, J. (2013) How do we optimally use cetuximab in first-line treatment for metastatic colorectal cancer? Future Oncol 9: 825–829.
[83] Ljung, R. (2013) Hemophilia and prophylaxis. Pediatr Blood Cancer 60(Suppl. 1): S23–S26.
[84] Lorenz, C., Fotin-Mleczek, M., Roth, G., Becker, C., Dam, T., Verdurmen, W. ir kt., (2011) Protein expression from exogenous mRNA: uptake by receptor-mediated endocytosis and trafficking via the lysosomal pathway. RNA Biol 8: 627–636.
[85] Madan, R., Bilusic, M., Heery, C., Schlom, J. and Gulley, J. (2012) Clinical evaluation of TRICOM vector therapeutic cancer vaccines. Semin Oncol 39: 296–304.
[86] Mandal, P. and Rossi, D. (2013) Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Nat Protoc 8: 568–582.
[87] Marichal, T., Ohata, K., Bedoret, D., Mesnil, C., Sabatel, C., Kobiyama, K. ir kt., (2011) DNA released from dying host cells mediates aluminum adjuvant activity. Nat Med 17: 996–1002.
[88] Martinon, F., Krishnan, S., Lenzen, G., Magne, R., Gomard, E., Guillet, J. ir kt., (1993) Induction of virus-specific cytotoxic T lymphocytes in vivo by liposome-entrapped mRNA. Eur J Immunol 23: 1719–1722.
[89] Mbow, M., De Gregorio, E., Valiante, N. and Rappuoli, R. (2010) New adjuvants for human vaccines. Curr Opin Immunol 22: 411–416.
[90] Moots, R. and Naisbett-Groet, B. (2012) The efficacy of biologic agents in patients with rheumatoid arthritis and an inadequate response to tumour necrosis factor inhibitors: a systematic review. Rheumatology (Oxford) 51: 2252–2261.
[91] Morse, M., Hobeika, A., Osada, T., Berglund, P., Hubby, B., Negri, S. ir kt., (2010) An alphavirus vector overcomes the presence of neutralizing antibodies and elevated numbers of Tregs to induce immune responses in humans with advanced cancer. J Clin Invest 120: 3234–3241.
[92] Naik, S., Metcalf, D., van Nieuwenhuijze, A., Wicks, I., Wu, L., O’Keeffe, M. ir kt., (2006) Intrasplenic steady-state dendritic cell precursors that are distinct from monocytes. Nat Immunol 7: 663–671.
[93] Neyns, B., Wilgenhof, S., Van Nuffel, A., Benteyn, D. and Corthals, J., Heirman, C. ir kt., (2012) Phase IB study on combined intradermal (ID) and intravenous (IV) administration of autologous mRNA electroporated dendritic cells (DC) as a singleagent cellular immunotherapy or combined with ipilimumab. J Clin Oncol 30(Suppl.): abstract 2507.
[94] O’Neill, D., Adams, S. and Bhardwaj, N. (2004) Manipulating dendritic cell biology for the active immunotherapy of cancer. Blood 104: 2235–2246.
[95] Okada, T., Miller, M., Parker, I., Krummel, M., Neighbors, M., Hartley, S. ir kt., (2005) Antigenengaged B cells undergo chemotaxis toward the T zone and form motile conjugates with helper T cells. PLoS Biol 3: e150.
[96] Panjarian, S., Iacob, R., Chen, S., Engen, J. and Smithgall, T. (2013) Structure and dynamic regulation of Abl kinases. J Biol Chem 288: 5443–5450.
[97] Pascolo, S. (2004) Messenger RNA-based vaccines. Expert Opin Biol Ther 4: 1285–1294.
[98] Pascolo, S. (2006) Vaccination with messenger RNA. Methods Mol Med 127: 23–40.
[99] Petsch, B., Schnee, M., Vogel, A., Lange, E., Hoffmann, B., Voss, D. ir kt., (2012) Protective efficacy of in vitro synthesized, specific mRNA vaccines against influenza A virus infection. Ant Biotechnol 30: 1210–1216.
[100] Pichlmair, A., Schulz, O., Tan, C., Naslund, T., Liljeström, P., Weber, F. ir kt., (2006) RIG-Imediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5’-phosphates. Science 314: 997–1001.
[101] Pollard, C., Rejman, J., De Haes, W., Verrier, B., Van Gulck, E., Naessens, T. ir kt., (2013) Type I IFN counteracts the induction of antigen-specific immune responses by lipid-based delivery of mRNA vaccines. Mol Ther 21: 251–259.
[102] Quintas-Cardama, A. and Jabbour, E. (2013) Considerations for early switch to nilotinib or dasatinib in patients with chronic myeloid leukemija with inadequate response to first-line imatinib. Leuk Res 37: 487–495.
[103] Rehwinkel, J., Tan, C., Goubau, D., Schulz, O., Pichlmair, A., Bier, K. ir kt., (2010) RIG-I detects viral genomic RNA during negative-strand RNA virus infection. Cell 140: 397–408.
[104] Rittig, S., Haentschel, M., Weimer, K., Heine, A., Muller, M., Brugger, W. ir kt., (2011) Intradermal vaccinations with RNA coding for TAA generate CD8+ and CD4+ immune responses and induce clinical benefit in vaccinated patients. Mol Ther 19: 990–999.
[105] Robak, T. (2012) Rituximab for chronic lymphocytic leukemia. Expert Opin Biol Ther 12: 503–515.
[106] Roesler, E., Weiss, R., Weinberger, E., Fruehwirth, A., Stoecklinger, A., Mostbock, S. ir kt., (2009) Immunize and disappear-safety-optimized mRNA vaccination with a panel of 29 allergens. J Allergy Clin Immunol 124: 1070–1077 e1071-1011.
[107] Russo, C., Cornella-Taracido, I., Galli-Stampino, L., Jain, R., Harrington, E., Isome, Y. ir kt., (2011) Small molecule toll-like receptor 7 agonists localize to the MHC class II loading compartment of human plasmacytoid dendritic cells. Blood 117: 5683–5691.
[108] Sardesai, N. and Weiner, D. (2011) Electroporation delivery of DNA vaccines: prospects for success. Curr Opin Immunol 23: 421–429.
[109] Schadendorf, D., Ugurel, S., Schuler-Thurner, B., Nestle, F., Enk, A., Brocker, E. ir kt., (2006) Dacarbazine (DTIC) versus vaccination with autologous peptide-pulsed dendritic cells (DC) in first-line treatment of patients with metastatic melanoma: a randomized phase III trial of the DC study group of the DeCOG. Ann Oncol 17: 563–570.
[110] Scheel, B., Teufel, R., Probst, J., Carralot, J., Geginat, J., Radsak, M. ir kt., (2005) Toll-like eceptordependent activation of several human blood cell types by protamine-condensed mRNA. Eur J Immunol 35: 1557–1566.
[111] Scheiblhofer, S., Gabler, M., Leitner, W., Bauer, R., Zoegg, T., Ferreira, F. ir kt., (2006a) Inhibition of type I allergic responses with nanogram doses of repliconbased DNA vaccines. Allergy 61: 828–835.
[112] Scheiblhofer, S., Thalhamer, J. and Weiss, R. (2013) Laser microporation of the skin: prospects for painless application of protective and therapeutic vaccines. Expert Opin Drug Deliv 10: 761–773.
[113] Scheiblhofer, S., Weiss, R., Gabler, M., Leitner, W. and Thalhamer, J. (2006b) Replicase-based DNA vaccines for allergy treatment. Methods Mol Med 127: 221–235.
[114] Schlake, T., Thess, A., Fotin-Mleczek, M. and Kallen, K. (2012) Developing mRNA-vaccine technologies. RNA Biol 9: 1319–1330.
[115] Schulz, O., Diebold, S., Chen, M., Naslund, T., Nolte, M., Alexopoulou, L. ir kt., (2005) Toll-like receptor 3 promotes cross-priming to virus-infected cells. Nature 433: 887–892.
[116] Sebastian, M., von Boehmer, L., Zippelius, A., Mayer, F., Reck, M., Atanackovic, ir kt., (2011) Messenger RNA vaccination in NSCLC: findings from a phase I/IIa clinical trial. J Clin Oncol 29(Suppl.): abstract 2584.
[117] Sebastian, M., von Boehmer, L., Zippelius, A., Mayer, F. and Reck, M. Atanackovic, D. ir kt., (2012) Messenger RNA vaccination and B-cell responses in NSCLC patients. . J Clin Oncol 30(Suppl.): abstract 2573.
[118] Sellam, J., Rouanet, S., Hendel-Chavez, H., Miceli-Richard, C., Combe, B., Sibilia, J. ir kt., (2013) CCL19, a B-cell chemokine, is related to the decrease of blood memory B-cells and predicts the clinical response to rituximab in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 65: 2253–2261.
[119] Shin, H. and Wherry, E. (2007) CD8 T cell dysfunction during chronic viral infection. Curr Opin Immunol 19: 408–415.
[120] Slovin, S., Kehoe, M., Durso, R., Fernandez, C., Olson, W., Gao, J. ir kt., (2013) A phase I dose escalation trial of vaccine replicon particles (VRP) expressing prostatespecific membrane antigen (PSMA) in subjects with prostate cancer. Vaccine 31: 943–949.
[121] Specenier, P. and Vermorken, J. (2013) Cetuximab: its unique place in head and neck cancer treatment. Biologics 7: 77–90.
[122] Spranger, S., Frankenberger, B. and Schendel, D. (2012) NOD/scid IL-2Rg(null) mice: a preclinical model system to evaluate human dendritic cell-based vaccine strategies in vivo. J Transl Med 10: 30.
[123] Spranger, S., Javorovic, M., Burdek, M., Wilde, S., Mosetter, B., Tippmer, S. ir kt., (2010) Generation of Th1-polarizing dendritic cells using the TLR7/8 agonist CL075. J Immunol 185: 738–747.
[124] Sullenger, B. and Gilboa, E. (2002) Emerging clinical applications of RNA. Nature 418: 252–258.
[125] Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K. ir kt., (2007) Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 131: 861–872.
[126] Takahashi, K. and Yamanaka, S. (2006) Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126: 663–676.
[127] Takatsu, K. and Nakajima, H. (2008) IL-5 and eosinophilia. Curr Opin Immunol 20: 288–294.
[128] Tang, D., DeVit, M. and Johnston, S. (1992) Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. Nature 356: 152–154.
[129] Thalhamer, T., Dobias, H., Stepanoska, T., Proll, M., Stutz, H., Dissertori, O. ir kt., (2010) Designing hypoallergenic derivatives for allergy treatment by means of in silico mutation and screening. J Allergy Clin Immunol 125: 926–934 e910.
[130] Ulmer, J., Donnelly, J., Parker, S., Rhodes, G., Felgner, P., Dwarki, V. ir kt., (1993) Heterologous protection against influenza by injection of DNA encoding a viral protein. Science 259: 1745–1749.
[131] Ulmer, J., Mason, P., Geall, A. and Mandl, C. (2012) RNA-based vaccines. Vaccine 30: 4414–4418.
[132] Vaine, M., Wang, S., Crooks, E., Jiang, P., Montefiori, D., Binley, J. ir kt., (2008) Improved induction of antibodies against key neutralizing epitopes by human immunodeficiency virus type 1 gp120 DNA prime-protein boost vaccination compared to gp120 protein-only vaccination. J Virol 82: 7369–7378.
[133] Van den Bosch, G., Van Gulck, E., Ponsaerts, P., Nijs, G., Lenjou, M., Apers, L. ir kt., (2006) Simultaneous activation of viral antigen-specific memory CD4+ and CD8+ T-cells using mRNAelectroporated CD40-activated autologous B-cells. J Immunother 29: 512–523.
[134] Van Gulck, E., Vlieghe, E., Vekemans, M., Van Tendeloo, V., Van De Velde, A., Smits, E. ir kt., (2012) mRNA-based dendritic cell vaccination induces potent antiviral T-cell responses in HIV-1-infected patients. AIDS 26: F1–F12.
[135] Vanham, G. and Van Gulck, E. (2012) Can immunotherapy be useful as a ’functional cure‘ for infection with human immunodeficiency virus-1? Retrovirology 9: 72.
[136] Van Lint, S., Goyvaerts, C., Maenhout, S., Goethals, L., Disy, A., Benteyn, D. ir kt., (2012) Preclinical evaluation of TriMix and antigen mRNA-based antitumor therapy. Cancer Res 72: 1661–1671.
[137] Van Lint, S., Heirman, C., Thielemans, K. and Breckpot, K. (2013) mRNA: From a chemical blueprint for protein production to an off-the-shelf therapeutic. Hum Vaccin Immunother 9: 265–274.
[138] Van Nuffel, A., Benteyn, D., Wilgenhof, S., Corthals, J., Heirman, C., Neyns, B. ir kt., (2012a) Intravenous and intradermal TriMix-dendritic cell therapy results in a broad T-cell response and durable tumor response in a chemorefractory stage IV-M1c melanoma patient. Cancer Immunol Immunother 61: 1033–1043.
[139] Van Nuffel, A., Benteyn, D., Wilgenhof, S., Pierret, L., Corthals, J., Heirman, C. ir kt., (2012b) Dendritic cells loaded with mRNA encoding full-length tumor antigens prime CD4+ and CD8+ T cells in melanoma patients. Mol Ther 20: 1063–1074.
[140] Van Nuffel, A., Wilgenhof, S., Thielemans, K. and Bonehill, A. (2012c) Overcoming HLA restriction in clinical trials: Immune monitoring of mRNA-loaded DC therapy. Oncoimmunology 1: 1392–1394.
[141] Vogelstein, B., Papadopoulos, N., Velculescu, V., Zhou, S., Diaz, L., Jr and Kinzler, K. (2013) Cancer genome landscapes. Science 339: 1546–1558.
[142] Wallner, M., Hauser, M., Himly, M., Zaborsky, N., Mutschlechner, S., Harrer, A. ir kt., (2011) Reshaping the Bet v 1 fold modulates T(H) polarization. J Allergy Clin Immunol 127: 1571–1578 e1579.
[143] Walsh, K., Teijaro, J., Zuniga, E., Welch, M., Fremgen, D., Blackburn, S. ir kt., (2012) Toll-like receptor 7 is required for effective adaptive immune responses that prevent persistent virus infection. Cell Host Microbe 11: 643–653.
[144] Walter, S., Weinschenk, T., Stenzl, A., Zdrojowy, R., Pluzanska, A., Szczylik, C. ir kt., (2012) Multipeptide immune response to cancer vaccine IMA901 after single-dose cyclophosphamide associates with longer patient survival. Nat Med 18: 1254–1261.
[145] Wang, S., Kishko, M., Wan, S., Wang, Y., Brewster, F., Gray, G. ir kt., (2012) Pilot study on the immunogenicity of paired Env immunogens from mother-to-child transmitted HIV-1 isolates. Hum Vaccin Immunother 8: 1638–1647.
[146] Warren, L., Manos, P., Ahfeldt, T., Loh, Y., Li, H., Lau, F. ir kt., (2010) Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell 7: 618–630.
[147] Weide, B., Carralot, J., Reese, A., Scheel, B., Eigentler, T., Hoerr, I. ir kt., (2008) Results of the first phase I/II clinical vaccination trial with direct injection of mRNA. J Immunother 31: 180–188.
[148] Weide, B., Pascolo, S., Scheel, B., Derhovanessian, E., Pflugfelder, A., Eigentler, T. ir kt., (2009) Direct injection of protamine-protected mRNA: results of a phase 1/2 vaccination trial in metastatic melanoma patients. J Immunother 32: 498–507.
[149] Weiss, R., Scheiblhofer, S., Roesler, E., Weinberger, E. and Thalhamer, J. (2012) mRNA vaccination as a safe approach for specific protection from type I allergy. Expert Rev Vaccines 11: 55–67.
[150] Weiss, R., Scheiblhofer, S. and Thalhamer, J. (2006) DNA vaccines for allergy treatment. Methods Mol Med 127: 253–267.
[151] Wherry, E., Blattman, J., Murali-Krishna, K., van der Most, R. and Ahmed, R. (2003) Viral persistence alters CD8 T-cell immunodominance and tissue distribution and results in distinct stages of functional impairment. J Virol 77: 4911–4927.
[152] Wickens, M. (1990) How the messenger got its tail: addition of poly(A) in the nucleus. Trends Biochem Sci 15: 277–281.
[153] Wilgenhof, S., Pierret, L., Corthals, J., Van Nuffel, A., Heirman, C., Roelandt, T. ir kt., (2011a) Restoration of tumor equilibrium after immunotherapy for advanced melanoma: three illustrative cases. Melanoma Res 21: 152–159.
[154] Wilgenhof, S., Van Nuffel, A., Corthals, J., Heirman, C., Tuyaerts, S., Benteyn, D. ir kt., (2011b) Therapeutic vaccination with an autologous mRNA electroporated dendritic cell vaccine in patients with advanced melanoma. J Immunother 34: 448–456.
[155] Wilgenhof, S., Van Nuffel, A., Benteyn, D., Corthals, J., Aerts, C., Heirman, C. ir kt., (2013) Phase IB study on intravenous synthetic mRNA electroporated dendritic cell immunotherapy in pretreated advanced melanoma patients. Ann Oncol 24: 2686–2693.
[156] Wolff, J., Malone, R., Williams, P., Chong, W., Acsadi, G., Jani, A. ir kt., (1990) Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science 247: 1465–1468.
[157] Wollenberg, A., Wagner, M., Gunther, S., Towarowski, A., Tuma, E., Moderer, M. ir kt., (2002) Plasmacytoid dendritic cells: a new cutaneous dendritic cell subset with distinct role in inflammatory skin diseases. J Invest Dermatol 119: 1096–1102.
[158] Xiong, C., Levis, R., Shen, P., Schlesinger, S., Rice, C. and Huang, H. (1989) Sindbis virus: an efficient, broad host range vector for gene expression in animal cells. Science 243: 1188–1191.
[159] Yakubov, E., Rechavi, G., Rozenblatt, S. and Givol, D. (2010) Reprogramming of human fibroblasts to pluripotent stem cells using mRNA of four transcription factors. Biochem Biophys Res Commun 394: 189–193.
[160] Yu, J., Vodyanik, M., Smuga-Otto, K., Antosiewicz-Bourget, J., Frane, J., Tian, S. ir kt., (2007) Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science 318: 1917–1920.
[161] Zangi, L., Lui, K., von Gise, A., Ma, Q., Ebina, W., Ptaszek, L. ir kt., (2013) Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction. Ant Biotechnol 8 September (Epub ahead of print).
[162] Zhou, X., Berglund, P., Rhodes, G., Parker, S., Jondal, M. and Liljeström, P. (1994) Self-replicating Semliki Forest virus RNA as recombinant vaccine. Vaccine 12: 1510–1514.

Lecturer