Regeneracinių organizmo galimybių ir mechanizmų tyrimai ir jais pagrįstų gydymo technologijų kūrimas

Free Register

Įvadas

Regeneracija yra biologinės savireguliacijos procesas, kurio metu organizmas sugeba atkurti ląsteles, organus arba atnaujinti jų funkciją (Baptista ir Atala, 2014). 1992 metais L. Kaiser pasiūlė „regeneracinės medicinos“ terminą. Šis terminas apibūdina procesą, kurio metu pažeistos ląstelės yra pakeičiamos sveikomis ląstelėmis. Regeneracijai ypač svarbios kamieninės ląstelės (KL). Šios ląstelės užtikrina normalią audinio regeneraciją, pakeisdamos degeneravusias jo ląsteles. Tokie audiniuose vykstantys degeneracijos–regeneracijos ciklai padeda audiniui išlaikyti savo funkcijas (Hwang ir kt., 2009). KL pasižymi unikaliomis savybėmis, išskiriančiomis jas iš kitų ląstelių tipų. KL yra nespecializuotos ląstelės ir gali diferencijuotis į kitų tipų specializuotas ląsteles. Svarbu pažymėti, kad kol šios ląstelės nesidiferencijuoja, jos neatlieka jokios specifinės funkcijos (Schmitt ir kt., 2012).

Kamieninės ląstelės

Klasifikuojant KL remiamasi jų savybėmis. Klasifikacija pagal diferenciacijos potencialą skirstoma į kelias grupes – tai totipotentinės, pliuripotentinės ir multipotentinės KL. Totipotentinės susidaro apvaisinimo metu, susiliejus lytinėms ląstelėms: kiaušialąstei ir spermatozoidui. Susidariusi zigota yra totipotentinė ląstelė, kuri pasižymi dideliu diferenciacijos potencialu dėl gebėjimo diferencijuotis į visas organizmo ląsteles. Vėliau vyksta diferenciacija į embrionines kamienines ląsteles (EKL), tai pliuripotentinės KL (Shanthly ir kt., 2006). Iš šių ląstelių vystosi visų gemalinių lapelių: mezodermos, endodermos ir ektodermos ląstelės (Kanno, 2013). Multipotentinės KL, tai labiau diferencijuotos ląstelės, lyginant su pliuripotentinėmis ir totipotentinėmis KL. Šios ląstelės diferencijuoja į tam tikrą ląstelių tipą, priklausomai nuo audinio tipo (Shanthly ir kt., 2006).

Klasifikuojant KL pagal jų kilmę, išskiriamos EKL, vaisiaus KL ir suaugusio organizmo KL. Apvaisinimo metu, susidarius zigotai, vėliau vyksta zigotos ląstelių (blastomerų) dalijimasis. Kai jų susidaro apie 12, zigota virsta morule, vėliau – blastocista. Ją sudaro blastocistinė ertmė, trofoblastas ir embrioblastas. Embrioblasto viduje esančios ląstelės yra vadinamos vidine ląstelių mase. Iš šių ląstelių susidaro epiblastas ir hipoblastas – tai pagrindinis EKL šaltinis (Fomčenko ir Gudlevičienė, 2013). EKL gaunamos iš 5–7 dienų embrionų, likusių po dirbtinio apvaisinimo ar kitų procedūrų. EKL yra pluripotentinės ir geba diferencijuoti į beveik visų tipų ląsteles, todėl jos gali būti pritaikytos labai plačiam ligų spektrui gydyti. Tačiau tai, kad žmogaus EKL yra kilusios iš ankstyvųjų žmonių embrionų, kelia jų terapinio panaudojimo etikos klausimus, be to, jei nebus sukurta daug žmonių EKL linijų, kad būtų galima parinkti įvairiems pacientams tinkančius ŽLA haplotipus, imuninio suderinamumo trūkumas gali taip pat kelti problemų, taikant jas klinikiškai.

2006 metais nustatyta, kad somatinę ląstelę galima perprogramuoti ir aktyvuoti jos potencialą, todėl jau subrendusi ląstelė grąžinama į pliuripotentinės ląstelės būvį – tai indukuotos pliuripotentinės kamieninės ląstelės (iPKL) (angl. Induced pluripotent stem cells, sutr. iPSC) (Takahashi ir Yamanaka, 2006; Takahashi ir kt., 2007; Condic ir Rao, 2010). Ląstelės perprogramuojamos į jas įterpiant specialius genus ir virusus (Sox2, Oct4, Nanog, onkogeniniai veiksniai: c-Myc, Klf4) (Takahashi ir Yamanaka, 2006; Takahashi ir kt., 2007; Porada ir Almeida-Porada, 2010). Ląstelė įgauna EKL būdingų savybių ir pasižymi dideliu potencialu. IPKL panaudojimas galėtų padėti išvengti problemų, kylančių naudojant EKL, nes iš esmės neturėtų sukelti etinių klausimų ar imuninio nesuderinamumo, kadangi gali būti naudojamos to paties paciento ląstelės. Tačiau buvo paskelbta, kad iPKL transplantacija sukėlė imuninio atmetimo reakciją pelėms (Zhao ir kt., 2011). Be to, kad EKL ir I PKL transkriptomos šiek tiek skiriasi, iPKL gali būti pasilikusios ląstelių tipo, iš kurio jos buvo padarytos epigenetinės atminties, taip pat jos gali turėti sukaupusios didesnį mutacijų kiekį nei EKL (Kim ir kt., 2010; Hansson ir Lendahl, 2013). Taigi dar reikia nemažai išsiaiškinti, ar transkriptomos skirtumai, pavyzdžiui, aukštas mutacijų balastas ir „epigenetinė atmintis“, turės funkcinės įtakos ląstelėms, diferencijuotoms iš iPKL. Be to, konkrečių tipų tikslinių ląstelių paruošimas reikalauja daug ląstelių kultūrų taikymo, ir dėl liekamųjų nediferencijuotų ląstelių po transplantacijos išlieka navikų formavimosi rizika (Matsui ir kt., 2014). 

Suaugusio organizmo KL yra po gimimo audiniuose reziduojančios nediferencijuotos ląstelės, pasižyminčios gebėjimu diferencijuoti į specifines audinio ląsteles. Todėl suaugusio organizmo KL ypač svarbios normaliam organizmo vystymuisi ir pažeisto audinio regeneracijos procesams (Hwang ir kt., 2009). Suaugusio organizmo KL panaudojimas nekelia etinių ir moralinių diskusijų.

KL audinio regeneracijos procese dalyvauja keliais skirtingais būdais. Jos geba diferencijuotis į audiniui specifines ląsteles ir taip pakeisti pažeistą audinį. Taip pat KL netiesiogiai gali paskatinti tirpių veiksnių, kurie svarbūs proliferacijos, diferenciacijos procesams, taip pat uždegimo procesams, sekreciją (Schmitt ir kt., 2012). 

Mezenchiminės suaugusio organizmo kamieninės ląstelės (MKL) ar į jas panašios gali būti išskirtos iš įvairių audinių: kaulų čiulpų, skeleto raumenų, riebalinio audinio, virkštelės kraujo, amnioninio skysčio, periferinio kraujo, sinovijos, danties pulpos, širdies, plaučių, kepenų (Hwang ir kt., 2009). Kaulų čiulpai yra populiariausias, gana lengvai gaunamas įvairių suaugusio organizmo KL, hematopoetinių (HKL) ir MKL, šaltinis.

Hematopoetinės kamieninės ląstelės

HKL transplantacija (HKLT) klinikoje naudojama hematopoezės atstatymui pacientams po mieloabliacinės ar nemieloabliacinės radioterapijos ar chemoterapijos. Kaulų čiulpų bei jose esančių KL transplantacija tradiciškai taikoma įvairių hematologinių susirgimų, dažniausiai onkohematologinių, gydymui. Jau keletą dešimtmečių tiriamos galimybės transplantuoti iš kaulų čiulpų išskirtas HKL ligoniams, sergantiems ūmiomis, kitoms terapijoms nepasiduodančiomis, autoimuninių ligų formomis. Dėl potencialo diferencijuotis į visus, tiek mieloidinių, tiek limfoidinių linijų, kraujo ląstelių tipus, HKL naudojamos kraujodaros bei defektyvios imuninės sistemos atkūrimui. Transplantacijai HKL gali būti išskiriamos iš kaulų čiulpų punktato arba iš periferinio kraujo, pastaruoju atveju KL iš kaulų čiulpų į periferinį kraują mobilizuojamos ciklofosfamidu bei granuliocitų kolonijas stimuliuojančiu faktoriumi (G-CSF). Dažniausiai transplantuojama visa išskirtų mononuklearinių ląstelių frakcija, arba tik teigiama CD34+ ekspresuojančių selekcija atrinktos HKL. Šiuo metu laikoma, kad autologinė HKLT nėra iki galo išgydanti, o alogeninė terapija, t. y. donoro KL transplantacija pasižymi geresniu išgydomuoju potencialu, tačiau jos taikymo galimybes riboja sąlyginai didelis tokios procedūros toksiškumas bei transplantato prieš šeimininką ligos (GvHD – graft-versus-host disease) rizika. Akivaizdu, kad tiek autologinės, tiek alogeninės HKLT efektą ir riziką dar reikia patikslinti, ypač atsižvelgiant į kitokių būdų gydyti onkohematologines ar autoimunines ligas pažangą. 

Mezenchiminės kamieninės ląstelės

Pagrindinės teigiamos MKL savybės – gebėjimas atsinaujinti ir diferencijuotis į tokio audinio ląsteles, kuriame yra aptinkamos. Šių ląstelių gebėjimas regeneruoti pažeistą audinį naudingas ir ypač svarbus klinikinėje praktikoje (Desando ir kt., 2013). 

MKL pasižymi diferenciacijos potencialu ir geba diferencijuoti į chondrocitus, adipocitus, osteocitus bei kitas ląsteles ir taip formuoti kaulinį, kremzlinį, riebalinį bei kitus audinius (Salinas ir Anseth, 2009). MKL pasižymi plastiškumu, tai reiškia, jog šios ląstelės iš kitų audinių geba priimti unikalias ląstelių fenotipo, biochemines ir funkcines savybes (Bunnell ir kt., 2008). Dėl specifinių MKL savybių, intensyvios proliferacijos ir gebėjimo diferencijuoti į kaulo, kremzlės ir kitų skeleto audinių ląsteles kamieninės ląstelės gali būti pritaikytos regeneracinėje medicinoje. Tyrimais įrodyta, kad, panaudojant suaugusiųjų kaulų čiulpų ir kitų audinių kilmės MKL, galima regeneruoti skeleto audinius (Djouad ir kt., 2009; Jorgensen ir Noël, 2011). Išskiriamas ir MKL uždegimą slopinantis aktyvumas bei gebėjimas sudaryti anabolinę mikroaplinką (Porada ir Almeida–Porada, 2010).

Tarptautinė ląstelių terapijos draugija (angl. the International Society for Cellular Therapy, ISCT) išskiria keletą kriterijų, būdingų MKL. Pirmiausia MKL apibrėžiamos pagal jų paviršiaus antigenus. Jos ekspresuoja CD105, CD73, CD44, CD90, CD71, specifines adhezines molekules CD106, CD166, CD29. Tačiau MKL neekspresuoja hematopoetinių ląstelių paviršiaus žymenų: CD45, CD34, CD14, CD11, specifinių adhezijos molekulių: CD31, CD56, CD18 ir kostimuliacių molekulių: CD80, CD86 ir CD40 (Dominici ir kt., 2006; Goodman, 2013). Antrasis kriterijus, MKL standartinėmis kultivavimo sąlygomis privalo prikibti prie plastiko, kuriame auginamos ląstelės, dugno. Trečiasis kriterijus nurodo, jog MKL in vitro sąlygomis diferencijuojasi osteogenine, adipogenine ir chondrogenine kryptimis (Cawthorn, 2012). 

Identifikuota mažo dydžio molekulė – kartogeninas, kuris skatina MKL diferenciaciją chondrogenine kryptimi. Tyrime panaudojus du osteoartrito modelius gyvūnuose, stebimas teigiamas ir saugus kartogenino poveikis. Tai suteikia naujų įžvalgų chondrogenezės procesui ir jo reguliavimui, kuris labai svarbus MKL panaudojimui osteoartrito gydymui (Johnson ir kt., 2012; Mobasheri, 2013), kadangi skatina II tipo kolageno, agrekano, audinių kilmės užpildo metaloproteinazių slopiklių sintezę (Marini ir Forlino, 2012). 

Tarpląstelinėje aplinkoje yra tirpių metabolitų, jonų, baltymų, polisacharidų, taip pat ląstelinės kilmės pūslelių, kurių sudėtyje yra baltymų, RNR. Tarptautinė ląstelinės kilmės pūslelių tyrimų bendrija rekomenduoja, kad ląstelinės kilmės pūslelių terminu būtų apibūdinamos egzosomos (angl. exosomes, šis terminas nurodo pūslelių dydį nanometrais, diametras 50–100 nm), mažos pūslelės (angl. microvesicle, diametras 100–1 000 nm), mikrodalelės ir apoptotiniai kūneliai (1–5 μm). Todėl pripažįstama, kad šios pūslelės fiziologiškai yra svarbios tiek imuniniam, tiek embrioniniam vystymuisi, tačiau taip pat dalyvauja neurodegeneracinių ligų patofiziologijoje (Andaloussi ir kt., 2013; Lavoie ir Myles-Rosu, 2013). Poveikis gali būti dvejopas: ląstelinės kilmės pūslelės išskirtos iš KL geba slopinti apoptozę, skatinti ląstelių proliferaciją, perprogramuoti ląsteles, kurios būtinos audinių regeneracijai (Andaloussi ir kt., 2013). MKL sekretuoja ląstelinės kilmės pūsleles ir tai viena iš priežasčių šių ląstelių potencialiam panaudojimui terapijoje (Lavoie ir Myles-Rosu, 2013). Ląstelinės kilmės pūslelės slopina autoreaktyvių limfocitų proliferaciją ir skatina priešuždegiminių citokinų IL-10 ir TGF-β sekreciją. Nors šios ląstelinės kilmės pūslelės nebuvo naudojamos reumatinių ligų gydymui, tačiau jos gali pagerinti osteoartrito arba reumatoidinio artrito gydymo rezultatus, nes pasižymi fibrozę, apoptozę, uždegimą slopinančiu poveikiu bei regeneracinėmis savybėmis (Maumus ir kt., 2013). MKL gebėjimas reguliuoti imuninę sistemą yra vienas iš pagrindinių aspektų, kodėl šios ląstelės naudojamos gydymui (Lavoie ir Myles-Rosu, 2013). Suaugusio organizmo MKL gali būti išskiriamos ne tik iš kaulų čiulpų, bet ir iš riebalinio bei kitų audinių. 

Poodinis riebalinis audinys yra gausus ir lengvai prieinamas, todėl riebalinio audinio mezenchiminių kamieninių ląstelių (R-KL) paėmimo procedūra yra paprasta ir nepavojinga. Be to, nutukimas yra sparčiai plintanti problema visame pasaulyje, todėl kasmet vien Jungtinėse Amerikos Valstijose atliekama apie 400 000 riebalinio audinio pašalinimo operacijų. Pašalintas audinys gali būti panaudojamas gydymui, kadangi R-KL yra multipotentinės ir daug žadančios terapiniame pritaikyme, ypač regeneracinėje medicinoje (Bunnell ir kt., 2008). 

Fenotipiškai R-KL identifikuojamos pagal paviršiaus žymenis tėkmės citometru (CD45-, CD235a-, CD31-, CD34+). Rekomenduojama šiuos paviršiaus žymenis nustatyti kartu su kitais MKL žymenimis, taip R-KL atskiriant nuo kaulų čiulpų KL (CD36+, CD106-) (Lavoie ir Myles-Rosu, 2013). Pažymėtina, kad R-KL ir kaulų čiulpų KL imunofenotipai sutampa >90 %, pavyzdžiui, glikoproteinas CD34 nustatomas ankstyvuose R-KL pasažuose, tačiau neaptinkamas kaulų čiulpų KL. Nustatytas R-KL imunofenotipas atitinka, lyginant tarp skirtingų laboratorijų. Tačiau jis kinta priklausomai nuo ląstelių pasažavimo trukmės (Gimble ir kt., 2007). 

Adipocitų diferenciacijos metu bendrą R-KL potencialą lemia gausybė veiksnių, kurie lemia šių ląstelių teigiamą, saugų bei efektyvų panaudojimą. Manoma, kad jos tiek pat veiksmingos, kaip ir gausios (Parker ir Katz, 2006). Multipotentinėms R-KL priskiriamos ląstelės iš endodermos ir ektodermos, taip pat ir inkstų kanalėlių epitelines ląsteles, hepatocitus ir salelių tipo ląsteles (angl. islet-like cells). Galimybė diferencijuotis į šių tipų ląsteles atskleidžia naują R-KL klinikinį potencialą. Diferenciacija į salelių tipo ląsteles galima tik specifinėmis kultivavimo sąlygomis arba pakeičiant Pdx1 (kasos transkripcijos veiksnys) raišką. Šios ląstelės pasižymi kasos genų raiška, pavyzdžiui, insulino ir gliukagono; pasižymi β-ląstelių funkcijomis, pavyzdžiui, nuo gliukozės priklausomas insulino išsiskyrimas, ir po transplantacijos gali atkurti kasos funkciją diabetu sergančioms pelėms ir žiurkėms. Toks besiplečiantis R-KL galimybių sąrašas leidžia sudvejoti, gal šios ląstelės gali būti pliuripotentinės. Tačiau akivaizdu, kad įprastame vystymosi kontekste negali (Cawthorn, 2012). Nors naujausi tyrimai rodo, kad R-KL pliuripotentiškumas gali būti sukeliamas dirbtinai. Vėlesni tyrimai patvirtino ir išplėtė šiuos pastebėjimus, tiek su žmogaus, tiek su pelių R-KL. DNR metilinimo modeliai yra panašūs kaip iPKL, gautų iš R-KL ar kitų somatinių ląstelių tipų, panašaus laipsnio epigenetinis perprogramavimas tarp šių ląstelių. R-KL išskyrimo, paprastumas lengvina iPKL ląstelių sudarymą (Harasymiak–Krzyzanowska ir kt., 2013). Genetiškai manipuliuotos R-KL naudojamos priešvėžinėje terapijoje dėl produkuojamų fermentų, aktyvuojančių neaktyvią vaisto formą, onkolitinių virusų, apoptotinių ligandų ir angiogenezę slopinančių veiksnių. Galiausiai dėl multipotentiškumo ir genetinių manipuliacijų, R-KL sekretuoja daug veiksnių, kurie lemia tiek teigiamą, tiek neigiamą poveikį. Manoma, kad R-KL bent jau iš dalies gali skatinti kancerogenezę, kadangi sekretuoja SDF-1 ir CCL5 (Cawthorn, 2012). Priešingai, R-KL sekretuojamas smegenų neurotrofinis faktorius (BDNF) skatina nervinių ląstelių atkūrimą (Lopatina ir kt., 2011). HGF ir VEGF skatina neovaskuliarizaciją (Cawthorn, 2012). 

R-KL nauda akivaizdi esant diabetui, kepenų, inkstų pažeidimui, uždegiminėms ligoms ir kitoms (Cawthorn, 2012; Harasymiak–Krzyzanowska ir kt., 2013). MKL sekretuojami veiksniai yra tiesiogiai susiję, kad šias ląsteles būtų galima panaudoti kaulų ir sąnarių regeneracijai. Ląstelės pasižymi priešuždegiminiu poveikiu, tai buvo patvirtinta tyrimuose, kai R-KL injekcijos buvo leidžiamos į sąnarius osteoartritu sergantiems pacientams (Jorgensen, 2013).

Audinių inžinerija

Dėl donorinių audinių ir organų trūkumo daugeliui pacientų, sergančių sunkiomis, nepagydomomis ligomis, reikia ieškoti naujų gydymo būdų ir galimybių. Pastaruoju metu, siekiant atstatyti ar atnaujinti pažeistą audinį ar organą, audinių inžinerija tampa vienu perspektyviausių gydymo būdų. Jos metu stengiamasi atstatyti, pakeisti ar regeneruoti ląstelių, audinių (Atala ir kt., 2006; Pham ir kt., 2007) ar organų (Macchiarini ir kt., 2008) funkcijas, kurių sutrikimus gali sukelti bet kokia priežastis – įgimti susirgimai, ligos, traumos ar net senėjimas. 

Audinių inžinerijos būdu kuriant audinius ar organus, ant tridimensinių karkasų yra auginamos iš tikslinių šaltinių išskirtos ląstelės. Audinių inžinerijoje karkasai turėtų atkurti audinyje aptinkamo natyvaus užląstelinio užpildo biologines ir mechanines savybes, todėl itin svarbus tam tikro porų dydžio, elastingumo ir kitomis savybėmis pasižyminčio karkaso parinkimas (Baiguera ir kt., 2012). Išskirtos ląstelės turi prisitvirtinti prie karkaso visomis trimis dimensijomis, proliferuoti, sekretuoti užląstelinį užpildą, kuris, laikui bėgant, pakeičia biodegraduojantį karkasą. Idealūs audinių inžinerijos būdu sukurti karkasai turi pasižymėti tokiomis savybėmis: jų paviršius turi būti adhezyvus ląstelėms, kad jos galėtų prisitvirtinti; taip pat skatinti jų augimą; be to, diferencijuotos ląstelės turi išsaugoti savo funkcijas. Karkaso medžiaga, iš kurios jis pagamintas ir jo degradacijos produktai negali būti toksiški ir sukelti uždegimo in vivo. Be to, medžiagos, iš kurių gaminami karkasai, turi pasižymėti mechaniniu atsparumu in vivo. Taip pat jų poros turi būti pakankamo dydžio, kad ląstelės prisitvirtintų, gamintų užląstelinį užpildą (Baiguera ir kt., 2012; Amoabediny ir kt. 2011).

Tridimensiniai karkasai reikalingi kaulų, kremzlės, odos, kepenų, širdies, plaučių ir kitų audinių inžinerijai, siekiant kuo geriau atstatyti jų funkcijas. Kuriant audinius ar organus, per paskutinį dešimtmetį audinių inžinerijoje buvo sukurta ir įvairių tridimensinių biokarkasų rūšių. Dažniausiai kuriami trijų tipų karkasai: iš natūralios medžiagos (natūralūs polisacharidai arba baltymai – alginatas, želatina, hialurono rūgštis arba kolagenas ir kt.) (Cen ir kt., 2008), beląstelių natyvių audinių karkasai (pavyzdžiui, šlapimo pūslė), biodegraduojantys sintetiniai polimerai – poliglikolinė rūgštis (PGA), polipieno rūgštis (PLA) ir jų kopolimeras (PLGA), polianhidridai, poliortoesteris, polikaprolaktonas, polikarbonatas ir kt. (Atala, 2012). Deja, natūralių medžiagų pagrindu sukurti karkasai turi daug trūkumų, iš kurių didžiausias yra tas, kad yra sudėtinga sukurti erdvinę struktūrą ir ją palaikyti in vivo.

Regeneracinės medicinos tyrimuose  naudojami natyvūs kolagenu turtingi beląsteliai audinių karkasai yra gaunami pašalinant audinių ląstelinius komponentus (Chen ir kt., 1999). Tuomet po implantacijos karkasas pamažu degraduoja ir yra pakeičiamas permodeliuoto užląstelinio užpildo baltymų, kuriuos sintetina ir sekretuoja transplantuotos arba ant karkaso užaugintos ląstelės. Pavyzdžiui, buvo parodyta, kad beląsteliuose audinių karkasuose pagerėja ląstelių augimas ir urogenitalinių audinių regeneracija (šlaplės, šlapimo pūslės), o imunogeninio atmetimo reakcijų nenustatyta (Chen ir kt., 1999).

Kaip minėta, regeneracinėje medicinoje plačiai naudojami poliesteriai PGA, PLA, PLGA. Maisto ir vaistų administracijoje (FDA) jie buvo patvirtinti daugelyje panaudojimo žmogaus organizme sričių. PGA, PLA ir PLGA degradacijos produktai yra netoksiški, natūralūs metabolitai, kurie paprastai yra pašalinami iš organizmo CO2 ir vandens pavidalu arba įtraukiami į Krebso ciklą (Amoabediny ir kt., 2011). Kadangi šios medžiagos pasižymi termoplastiškumu, iš jų įvairiais metodais nesunkiai gali būti formuojami įvairių formų ir dydžių tridimensinės struktūros karkasai, palaikantys norimą mikrostruktūrą (Harris ir kt., 1998). Elektrospiningo metodas buvo taikytas, siekiant greitai sukurti įvairių konformacijų, didelio porėtumo karkasus (Han ir Gouma, 2006; Lee ir kt., 2008). 

Natūralios kilmės medžiagų ir beląstelių audinių karkasų pranašumas yra biologinis suderinamumas, o sintetinių polimerų karkasai pasirenkami dėl to, kad gali būti gaminami dideliu mastu, kontroliuojant kuriamo karkaso stiprumą, degradacijos laiką, mikrostruktūrą ir kitas savybes. Sintetinių polimerų trūkumas yra tas, jog ne visi yra biologiškai tinkami ir suderinami organizme. Į juos bandoma įterpti įvairių baltymų ir molekulių, dėl kurių jie taptų biologiškai suderinami (Atala, 2012).

Biodegraduojančių karkasų įvairovė yra labai didelė, o karkaso parinkimas priklauso nuo jo implantacijos priežasties. Vis dėlto biokarkaso, idealiai tinkančio pažeistam širdies, plautiniui, kremzliniui, kauliniui ir kt. audiniui atstatyti kol kas sukurti dar nepavyko, todėl išlieka aktualu ieškoti medžiagų bei būdų šių audinių regeneracijai ir reparacijai tinkamo karkaso sukūrimui.

Audinių inžinerijoje taip pat labai svarbu gauti atsinaujinantį ir pagausinamą ląstelių šaltinį, iš kurio būtų gaunamas reikiamas ląstelių, išlaikančių atitinkamo audinio fenotipą ir atliekančių reikiamą biologinę funkciją, kiekis. Ląstelės turi gaminti teisingos struktūros užląstelinį užpildą, sekretuoti citokinus ir kitas signalines molekules, sąveikauti su šalia esančiomis ląstelėmis / audiniais. Dėl to iškyla problemų ir parenkant ląstelių tipą bei jų šaltinį (Atala, 2012).

Audinių inžinerijai yra naudojamos įvairių tipų ląstelės – tai embrioninės KL, virkštelės kraujo, amnioninio skysčio KL ar suaugusiųjų KL. Iš blastocistos išskirtos embrioninės KL yra pluripotentinės ir geba diferencijuoti į beveik visų tipų ląsteles, jos gali būti pritaikytos įvairių ligų gydymui. Amnioninio skysčio KL gali būti indukuotos diferencijuoti adipogenine, osteogenine, miogenine, endotelio, nervine ir kepenų ląstelių kryptimis, joms nebūdingas navikų, be to, nėra etinių apribojimų, draudžiančių naudoti šias ląsteles, todėl jos yra potencialus ląstelių šaltinis, reikalingas audinių inžinerijai. Taip pat buvo parodyta, kad iPKL yra unikalios, neimunogeniškos ląstelės, autologinė EKL alternatyva. Šios ląstelės pasižymi labai aukštu diferenciacijos potencialu, tačiau keletas ikiklinikinių tyrimų parodė, jog iPKL galimai sukelia imuninį atsaką ir atmetimo reakcijas, ypač singeninių recipientų organizmuose (Baiguera ir kt., 2012).

Kaip minėta, daugiagaliosios suaugusiųjų organizmų KL (MKL) aptinkamos daugelyje audinių (širdyje, smegenyse, plaučiuose, inkstuose ir kt.). MKL pasižymi savybėmis, reikalingomis audinių inžinerijai, todėl pastaruoju metu plačiai taikomos terapiniams tikslams. MKL nesudėtingai išskiriamos iš įvairių audinių šaltinių, pagausinamos ir diferencijuojamos in vitro. Be to, tyrimai parodė, kad MKL nesukelia imuninio atsako, skatina gijimo, angiogenezės procesus (Wakitani ir kt., 2011). Taip pat tiesiogiai sąveikaudamos ląstelė-ląstelė ar sekretuodamos tam tikrus veiksnius, gali turėti itin didelės įtakos vietinio audinio reparacijos ir regeneracijos procesams (Baiguera ir kt., 2012). Dėl šių priežasčių MKL gali būti panaudotos įvairių sutrikimų gydymui, pavyzdžiui, reumatoidinio artrito, osteoartrito atvejais, taip pat genetiškai nulemtiems kaulų ir kremzlių sutrikimams (Djouad ir kt. 2009), širdies, plaučių ir kitų audinių bei organų ligų ar pažeidimų gydymui. Todėl MKL vis dažniau panaudojamos audinių inžinerijos metodais kuriant audinius bei organus (Baiguera ir kt., 2012). Kita vertus, MKL vis plačiau yra panaudojamos ne tik mezenchiminių audinių (kaulų, kremzlių) regeneracijai, bet ir kaip stimuliuojanti niša, tarpląsteliniais kontaktais ar parakrininiais efektais skatinanti kitų audinių regeneraciją – širdies raumens, kraujodaros sistemos, plaučių, odos ar kt. Daugelyje studijų įrodyta, kad MKL sekretuoja įvairias biologiškai aktyvias medžiagas, kurios mažina apoptozę, turi įtakos ląstelių išgyvenamumui, aktyvuoja reparacijos mechanizmus (Ohnishi ir Nagaya, 2008; Hind ir Maden, 2011).  

Regeneracinė medicina

Kad audinio atkūrimo procesas galėtų būti vadinamas regeneracija, jis turi atitikti keletą kriterijų: a) eksperimentiniais tyrimais turi būti įrodyta, kad organas yra labai pažeistas (pavyzdžiui, dėl ligos, vaistų ir kt. veiksnių) ar dalinai / visiškai pašalintas (pavyzdžiui, chirurginiu būdu), b) tyrimais turi būti įrodyta, kad organas yra visiškai regeneruotas – atnaujinta dauguma ląstelių tipų, organas atlieka savo funkciją – pritaikant ląstelių proliferacijos, diferenciacijos, žymėjimo metodus bei fiziologinius testus, c) studijose, kuriose panaudojamos iPKL, EKL ir MKL, reikia įrodyti, jog nesusiformuoja navikiniai dariniai. Pažeistas organas laikomas regeneruotu, kai atitinkami šie kriterijai (Baddour ir kt., 2012). 

Organo reparacijos procesas charakterizuojamas: a) epitelio proliferacija ir pažeistos vietos užpildymu bei b) fibrozės pašalinimu ir užląstelinio užpildo susidarymu (Baddour ir kt., 2012).

Viso pasaulio laboratorijose yra ieškoma būdų, ląstelių tipų, kuriami audinių inžinerijai skirti karkasai norint sukurti audinius ir organus, skirtus reparuoti ar regeneruoti pažeistas vietas ar visą organą, ir šiuos metodus ateityje pritaikyti klinikinėje praktikoje.

Kaip jau minėta, suaugusio žmogaus organizme cirkuliuojančios MKL geba migruoti į pažeistą audinį ir jį atstatyti. Dėl specifinių MKL savybių ir gebėjimo diferencijuoti bei imunosupresinio poveikio, jos potencialiai gali būti pritaikytos įvairių ląstelių transplantacijai ir regeneracinėje medicinoje. Buvo atlikta labai daug tyrimų in vivo, kurių metu buvo tirtas MKL gebėjimas regeneruoti įvairius audinius. Rezultatai parodė, kad transplantavus šias ląsteles, jos skatino gijimo ir audinio regeneracijos procesus netgi tais atvejais, kai prigydavo nedideli ląstelių kiekiai. Tai parodo, kad MKL gali ne tik diferencijuoti, bet ir atstatyti audinį. Prieš keletą metų buvo aprašyta, kad šios ląstelės sekretuoja tirpius veiksnius, kurie gali paveikti audinio mikroaplinką, taip atnaujinant ar atstatant pažeistus audinius ir ląsteles. Pavyzdžiui, Haynesworth su kolegomis parodė, kad MKL sekretuoja įvairius augimo veiksnius, citokinus ir adhezijos molekules. Tokie sekretuojami veiksniai yra svarbūs hematopoezės procesui. MKL išskirti bioveiksniai yra pavadinti „trofiniais veiksniais“ (Haynesworth ir kt., 1996). Terapinis MKL veiksmingumas galėtų būti dėl jų kompleksinės heterogeninės prigimties (Hwang ir kt., 2009). 

Pacientams, kurių organai yra pažeisti, yra atliekamos transplantacinės operacijos. Panaudojant vieną kūno dalį kitai arba vieno organizmo organo pakeitimas kitu medicininėje literatūroje buvo minimas net antikos laikais. Č. Lindbergas (Charles Lindbergh) buvo pirmasis pilotas, 1920 metais sėkmingai perskridęs Atlantą ir gabenęs organus, tirdamas jų laikymo sąlygas ex vivo (Carrel ir Lindbergh, 1935). Inkstas buvo pirmasis visas organas, kurio transplantacija buvo atlikta žmogui 1955 metais (Merrill ir kt., 1956). Tačiau šis transplantas buvo persodintas identiškam dvyniui, todėl nepasireiškė imuninio atsako reakcijų prieš transplantuotą organą. Kai 1960-aisiais Murray atliko inkstų transplantaciją tarp genetiškai nesusijusių pacientų ir nepasireiškė jokio imuninio atsako, prasidėjo nauja medicininės terapijos era ir pradėtos atlikti organų transplantacijos. Tačiau kitiems pacientams pasireiškiančios imunosupresinės reakcijos, nesugebėjimas kontroliuoti ir stebėti organo atmetimo reakcijų ir donorų trūkumas verčia ieškoti tokiai terapijai alternatyvų.

Įvairių organizmo audinių ir organų regeneraciniai pajėgumai skiriasi, todėl siekiant terapinio efekto svarbu parinkti tinkamiausias ląsteles bei gydymo strategijas.

Nervų sistema

Siekiant regeneruoti nervų sistemos audinius, reikalingas traumos ar ligos pažeistų nervinių ląstelių atstatymas arba pakeitimas naujomis. Nors žemesni organizmai turi didelius nervų sistemos regeneracijos gebėjimus, evoliuciškai aukštesniųjų organizmų, tarp jų ir žmonių, nervinių ląstelių atsinaujinimo galimybės yra labai ribotos, todėl nervų sistemos sužeidimų ar ligų gydymas kelia didelių iššūkių.

1998 m. Hideyuki Okano, bendradarbiaudamas su Steven Goldman, panaudoję neuroninių kamieninių ląstelių žymenį ribonukleino rūgštį (RNR) – binding protein Musashi1 – pirmą kartą parodė neuroninių kamieninių ląstelių / progenitorių buvimą suaugusio žmogaus smegenyse (Sakakibara ir kt., 1996; Pincus ir kt., 1998). Nuo tada prasidėjo nervų regeneracijos tyrimų era. Tais pačiais metais pradėti regeneracinės medicinos tyrimai taikant nervinių kamieninių ląstelių transplantaciją eksperimentiniuose gyvūnų su nugaros smegenų pažeidimais modeliuose. Persodinus iš žiurkės vaisiaus centrinės nervų sistemos (CNS) išskirtas nervines kamienines ląsteles (NKL) buvo atkurtos motorinės nugaros smegenų funkcijos (Ogawa ir kt., 2002). Šis tyrimas parodė, kad poūmis etapas po smegenų pažeidimo yra optimaliausias laikas NKL transplantacijai. Be to, šiame tyrime bent iš dalies buvo atskleistas mechanizmas, kaip NKL transplantacija atkuria smegenų funkciją. Tai tiek autonominis poveikis (sinapsių formavimasis tarp transplantuotų ir šeimininko neuronų), tiek trofinis poveikis sekretuojant citokinus ir taip stimuliuojant audinių reparaciją bei funkcinį atsistatymą. Vėliau tokie tyrimai buvo pakartoti su primatais (Okano ir Yamanaka, 2014).

Atsižvelgiant į minėtus rezultatus, buvo pradėta ruoštis klinikiniams tyrimams su žmogaus vaisiaus CNS kilmės NKL transplantacijoms gydyti. Tačiau, pagal 2006 m. įsigaliojusias Japonijos įstatymų gaires, žmogaus vaisiaus kilmės ląstelės ir EKL buvo laikomos netinkamomis naudoti regeneracinėje medicinoje (žmogaus EKL Japonijoje leista naudoti tik vėliau, pagal 2013 m. gaires). Taigi gydymo strategija buvo pakeista, NKL buvo diferencijuotos iš iPKL ir išbandytos pelėse. Vėliau parodyta, kad tokios žmogaus iPKL kilmės NKL ilgam laikui atstatė motorines pažeistų nugaros smegenų funkcijas tiek pelių, tiek primatų modeliuose, o navikų formavimosi nustatyta nebuvo (Nori ir kt., 2011). Šie ikiklinikinių tyrimų rezultatai buvo labai svarbūs įrodant potencialią NKL terapinę naudą, todėl pradėta ruoštis jų panaudojimui klinikiniuose tyrimuose su pacientais, patyrusiais stuburo traumas. 

Vėliau buvo sukurta gausybė įvairioms nervų sistemos ligoms specifiškų iPKL iš tomis ligomis sergančių pacientų somatinių ląstelių, o jos naudojamos tiriant įvairias nervų sistemos ligas, tokias kaip lateralinė amiotrofinė sklerozė, Friedreicho ataksija, Alzheimerio liga, Parkinsono liga, šizofrenija, epilepsijos Draveto sindromas, įvairios raumenų atrofijos ir daugelis kitų ligų (Okano ir Yamanaka, 2014). 

Visgi nervinio audinio regeneracija pasirodė gana sunkiai sprendžiama problema. Periferinių aksonų regeneraciją kai kuriais atvejais išties galima pasiekti, ypač kai tam reikalingas augimas nedideliais atstumais, tačiau centrinės nervų sistemos reparacija vis dar yra savo ankstyvojoje atradimų stadijoje. EKL ir iPKL gali suformuoti neuronus (Peljto ir Kuris-Terle, 2011; Morris ir Daley, 2013), o neseniai atliktas tyrimas rodo, kad fibroblastus įmanoma paversti neuronais tiesioginės konversijos (transdiferenciacijos) metodu, išvengiant iPKL stadijos (Caiazzo ir kt., 2011; Steward ir kt., 2013). Iš iPKL kilusių neuroninių ląstelių panaudojimas šiuo metu susiduria su tam tikrais trūkumais: 1) konkrečių tipų tikslinių neuroninių ląstelių paruošimas reikalauja daug ląstelių kultūrų taikymo, ir 2) dėl liekamųjų nediferencijuotų ląstelių po transplantacijos gali susidaryti navikai, todėl manoma, kad tiesioginės transdiferenciacijos metodu gautos NKL tokiais atvejais būtų pažangesnė alternatyva (Matsui, 2014). Tačiau reikia paminėti, kad metodų, leidžiančių užtikrinti efektyvių funkcinių jungčių formavimąsi bei neuronų schemos regeneravimą vis dar trūksta. 

Širdis

Šiuolaikinėje klinikinėje praktikoje dabartiniais gydymo metodais nepavyksta iki galo atkurti funkcionuojančių pažeistų audinių. Dėl atliekamų chirurginių intervencijų, po atliktų transplantacinių operacijų, pacientams pasireiškia šalutinis poveikis. Nors mechaninių stimuliatorių implantacija į pažeistus širdies audinius gali pagerinti širdies darbą, tačiau išlieka potenciali infekcijų ir krešulių susidarymo galimybė. 

Kiekvienais metais nuo širdies ir kraujagyslių ligų Europoje miršta daugiau nei 4 mln. žmonių ir daugiau nei 1,9 mln. – Europos Sąjungoje (European Cardiovascular Disease Statistics, 2012). Kasmet šios ligos yra vis dažniau diagnozuojamos. Siekiant sumažinti sergamumą ir mirštamumą, taikomas medikamentinis gydymas, tačiau vis dėlto esant širdies sutrikimams galiausiai atliekamos transplantacinės operacijos. Deja, labai dažnai po širdies transplantacijos pacientui pasireiškia šalutinis poveikis, pasireiškiantis persodinto organo atmetimo reakcija. Todėl yra ieškoma alternatyvių metodų atkurti ar pakeisti pažeistą širdies raumenį, taikant audinių inžinerijos ir regeneracinės medicinos technologijas (Atala, 2012). 

Infarkto pažeistoms vietoms atkurti taikoma ląstelių terapija, kurios metu į pažeistą audinio vietą yra atliekama ląstelių injekcija. Pažeisto širdies audinio regeneracijai dėl jų regeneracinio potencialo panaudojami įvairūs kamieninių ląstelių tipai (Atala, 2012). Šiam tikslui buvo panaudotos tiek širdies audinio KL, tiek kitų suaugusio organizmo audinių (skeleto raumenų, mezenchiminės ir hematopoetinės kaulų čiulpų), amnioninio skysčio, embrioninės KL ir iPKL. 

Taip pat taikyta ir endogeninių kamieninių ląstelių mobilizacija širdyje augimo faktoriais, pvz., SDF-1. Skeleto raumenų ląstelės ar MKL parodė tam tikrų teigiamų funkcinių efektų, tačiau diferenciacija į kardiomiocitus nevyko. Taigi, manoma, kad šių persodintų ląstelių efektai iš dalies gali būti paaiškinami jų parakrinių veiksnių moduliuojančiu poveikiu miokardo audinyje, pavyzdžiui, endogeninių ląstelių mobilizacija, taip paskatinant audinio regeneraciją (Kim ir kt., 2010; Hansson ir Lendahl, 2013).

Endogeninių širdies kamieninių ląstelių mobilizacija suaugusiųjų širdyje atrodo patraukli terapinė koncepcija, nors šios mokslinių tyrimų srities plėtrai dar trukdo keletas veiksnių. Pirmiausia ir svarbiausia tai, kad suaugusiųjų širdies kamieninės ląstelės nebuvo aiškiai apibūdintos, neaiški jų kilmė, jų paviršiaus žymenų biologinė reikšmė ir atsinaujinimo ar diferenciacijos reguliacija. Parakrininiai veiksniai, kurie kontroliuoja endogeninius regeneracinius mechanizmus širdyje išties atrodo aktuali tyrimų sritis, tačiau, siekiant juos racionaliai panaudoti klinikoje, reikėtų išsiaiškinti kurie iš jų tinkamiausi terapijoms ir kokie jų ląsteliniai taikiniai.

Daug pastangų buvo nukreipta optimalioms kultivavimo sąlygoms kardiomiocitų diferenciacijai nustatyti. Vis labiau sutariama, kad siekiant sėkmingai generuoti kardiomiocitus iš iPKL ir EKL reikia taikyti protokolus, kuriuose panaudojami TGF-β/BMP ir WNT signalinių kelių molekules. Tačiau akivaizdžiai yra būtinas išsamesnis tarpinių tarp pluripotencijos ir subrendusių kardiomiocitų stadijų ląstelių apibūdinimas, parodant, kaip minėtos ekstraląstelinės signalinės molekulės veikia skirtingais vystymosi etapais, taip pat reikalingas labai efektyvių diferenciacijos protokolų nustatymas. Be to, paaiškėjo, kad yra didžiulė kardiogeninio potencialo variacija tarp skirtingų žmogaus pliuripotencinių kamieninių ląstelių linijų. Šiuo metu stengiamasi tobulinti diferencijavimo protokolus, kad iš EKL ir iPKL gauti tikslaus diferenciacijos lygmens ląsteles ir padidinti tokių teisingo tipo ląstelių kiekius.

EKL kilmės kardiomiocitai buvo plačiai tyrinėti in vitro ir parodyta, kad jie pasižymėjo pirminiams kardiomiocitams būdingais molekuliniais žymenimis ir elektrofiziologinėmis, mechaninėmis ir ultrastruktūrinėmis savybėmis. Tačiau ES ląstelių kilmės kardiomiocitams būdingi vaisiaus, o ne suaugusiųjų kardiomiocitų požymiai (Murry ir kt., 2008), be to, iki šiol buvo sunku apibrėžti labiausiai skilvelinių kardiomiocitų generavimui tinkančias kultūros sąlygas (Kim ir kt., 2010; Hansson ir Lendahl, 2013). Abu šie klausimai gali būti labai svarbūs transplantacijai ir parodo, kad, nepaisant didėjančio in vitro diferenciacijos protokolų efektyvumo, reikalinga daugiau tyrimų tam, kad miokardo infarkto metu prarasti kardiomiocitai galėtų būti sukurti iš EKL ir iPKL. Be to, EKL atveju etiniai ir imuninio suderinamumo klausimai taip pat gali būti rimta problema. IPKL panaudojimas galėtų padėti išvengti problemų, kylančių naudojant EKL, nes iš esmės neturėtų sukelti etinių klausimų ar imuninio nesuderinamumo, kadangi gali būti naudojamos to paties paciento ląstelės. Tačiau, kaip minėta, iPKL gali pasilikti ląstelių tipo, iš kurio jos buvo padarytos epigenetinės atminties, taip pat jos gali turėti sukaupusios didesnį mutacijų kiekį nei EKL (Kim ir kt., 2010; Hansson ir Lendahl, 2013). 

Ląstelės gali būti suleidžiamos tiesiogiai į pažeistą širdies vietą arba užsėtos ant tam tikro karkaso, kuris po to implantuojamas į tikslinę audinio vietą. Šioje srityje yra atliekama daug tyrimų, siekiant parinkti tinkamas ląsteles, kurios prisitvirtintų prie biokarkaso ir optimaliai regeneruotų pažeistą audinį (Jawad ir kt., 2007).

Aprašyti širdies regeneraciją skatinantys metodai yra veiksmingi tik esant santykinai nedideliam pažeisto širdies raumens plotui. Esant didesniam pažeidimui, visa širdis tampa funkciškai neaktyvi ir tuo atveju taikomi kiti metodai. Tokiais atvejais biodirbtinės širdies persodinimas būtų itin tinkamas gydymo būdas, kuris padėtų išvengti organizmo atmetimo reakcijos ir sunkumų, iškylančių transplantuojant donoro širdį (pavyzdžiui, tromboembolijos susidarymas). Viena iš mokslininkų grupių gana neseniai sukūrė naują širdies konstruktą in vitro, panaudodami nuląstelintas lavonų širdis, ant kurių užsėjo įvairių tipų ląsteles, iš kurių sudarytas širdies raumuo (kardiomiocitus, lygiųjų raumenų, endotelio ląsteles ir fibroblastus). Tokia dirbtinė širdis buvo auginama bioreaktoriuje siekiant atkurti fiziologines sąlygas. Šiai grupei pavyko sukurti konstruktą, kuris atlieka siurblio funkciją (Ott ir kt., 2008). Galima manyti, jog ateityje bus sukurta biologinės kilmės dirbtinė širdis.

Mažai žinoma, kokiu principu kamieninės ląstelės regeneruoja pažeistą širdies audinį. Yra nustatyta, kad iš kamieninių ląstelių susidariusios įvairios ląstelės ekspresuoja skirtingus biožymenis. Pavyzdžiui, miokardo išemiją gydant MKL terapija pagerėja miokardo funkcija ir kapiliarų formavimasis (Zhang ir kt., 2007). Tačiau iki šiol galutinai nėra aiškus MKL veikimo mechanizmas patologinio miokardo vietoje. Tačiau yra nustatyti keli potencialūs jų veikimo mechanizmai: 1) augimo veiksnių išskyrimas aktyvuojant parakrininį citokinų poveikį, inicijuojantį vaskuliarizaciją, 2) širdies kamieninių ląstelių sutelkimas pažeistų ląstelių reparacijai, 3) poinfarktinių žaizdų gydymas, 4) jungčių susidarymas tarp MKL ir nepažeistų kardiomiocitų širdies audinyje ir pažeisto audinio atstatymas (Engelmann ir Franz, 2006).

Pažymėtina, kad transfekavus tam tikrais genais MKL, jos gali įgyti ir visai kitiems audiniams būdingą funkciją. Pavyzdžiui, atlikus HCN2 geno transfekciją, MKL gali tapti širdies ritmą generuojančiomis laidžiosios sistemos ląstelėmis.

Dabartinėje klinikinėje praktikoje širdies ritmo sutrikimams gydyti į širdį yra implantuojami elektroniniai stimuliatoriai. Teigiama, kad jie pasižymi patikimumu, sumažina sergamumą ir gali būti pasirenkami, kai nefunkcionuoja sinusinis širdies mazgas ir blokuojamas visos širdies darbas (Rosen ir kt., 2004). Tačiau elektroniniai stimuliatoriai nereaguoja į biologinės prigimties stimulus, į širdį yra įvedami elektrodai, o po tam tikro laiko stimuliatoriaus darbui pratęsti reikalingas baterijų pakeitimas. Todėl yra ieškoma būdų sukurti biologinės prigimties širdies stimuliatorių (Rosen ir kt., 2004).

Mechaniškai HCN2 geną ekspresuojančios MKL sukuria depoliarizuotą srovę, kuri sklinda į kardiomiocitus, plyšinėmis jungtimis susijungusius su transfekuotomis MKL. Tokiu būdu kardiomiocitai sužadinami ir priverčiami ritmiškai susitraukti. Buvo atlikti tyrimai, kurių metu minėtu genu buvo transfekuotos žmogaus MKL ir implantuotos į šuns širdies, iš kurios pašalintas atrioventrikulinis mazgas, skilvelį. Nustatyta, kad jos gebėjo generuoti širdies ritmą (Plotnikov ir kt., 2007).

Manoma, kad MKL ir genų terapijos pagrindu sukurti biologiniai stimuliatoriai ateityje galėtų tapti alternatyva elektroniniams (Rosen ir kt., 2004; Baruscotti ir kt., 2010).

Kraujagyslės

Įvairiems kraujagyslių pažeidimams pašalinti buvo panaudojamos ksenogeninės arba sintetinės medžiagos, kuriomis jos pakeičiamos. Tačiau šios medžiagos nepasižymi augimo potencialu, dėl to recipientui gali pasireikšti komplikacijų (Matsumura ir kt., 2003). Audinių inžinerijos būdu buvo sukurtos dirbtinės kraujagyslės, panaudojant autologinės kilmės ląsteles ir biodegraduojančius karkasus. Jos buvo tiriamos šunų ir ėriukų modeliuose (Atala, 2012). Pagrindinis tokių transplantacijai tinkamų kraujagyslių karkasų pranašumas yra tas, jog jie degraduoja in vivo ir dėl to gali formuotis naujas audinys (Matsumura ir kt., 2003). Tokios laboratorinėmis sąlygomis taikomos technologijos pradėtos taikyti ir klinikinėje praktikoje, išskiriant autologines kraujagyslių ląsteles, jas pagausinant ir užsėjant ant biodegraduojančio karkaso. Paskelbti duomenys, kuomet stenozės pažeista plaučio arterija buvo pakeista tokiu autologinės kilmės konstruktu (Shin’oka ir kt., 2001). Praėjus septyniems mėnesiams po implantacijos, recipientui nebuvo pastebėta transplanto okliuzijos ar aneurizminių pokyčių.

Trachėja

Yra žinoma keletas gydymo būdų, taikomų pacientams su įgimta trachėjos patologija (stenoze, atrezija, ageneze), atsižvelgiant į ribotas autologinio audinio persodinimo galimybes naujagimiams. Audinių inžinerija vaisiaus vystymosi laikotarpiu galėtų būti alternatyva chirurginėms intervencijoms šiuo laikotarpiu diagnozuotoms įgimtoms anomalijoms. Ląstelės galėtų būti išskirtos ir užaugintos ant transplantacijai skirto audinio dar gestacijos periodo metu. 

Iš ėriuko vaisiaus elastinės ir hialininės kremzlės išskirti chondrocitai pagausinti in vitro ir užsėti ant biodegraduojančio karkaso (Fuchs ir kt., 2002). Tuomet konstruktai buvo implantuoti kaip trachėjos audinio pakaitalas į ėriuko vaisių. Buvo pažymėta, kad audinių inžinerijos būdu sukurta kremzlė prigijo ir apaugo epitelio sluoksniu, kuris palaiko jos struktūrą. Be to, jeigu natyvus trachėjos audinys nefunkcionalus, kremzlė taip pat galėtų būti sukurta iš kaulų čiulpų išskirtų mezenchiminių progenitorinių ląstelių (Fuchs ir kt., 2003).

Tačiau ši technologija negali būti pritaikyta kuriant didesnius trachėjos segmentus, todėl negali būti panaudota siekiant atkurti ar pakeisti suaugusio žmogaus pažeistą ar ligos paveiktą trachėją. 2008 m. gruodį buvo atlikta pirmoji audinių inžinerijos būdu sukurtos žmogaus trachėjos implantacija (Macchiarini ir kt., 2008). Kuriant karkasą, tinkantį pakeisti trachėją, ši mokslininkų grupė pirmiausia iš donoro trachėjos pašalino visas ląsteles ir antigenų suderinamumo kompleksą. Ant šio donorinio beląstelio karkaso buvo užsėtos epitelinės ląstelės ir MKL kilmės chondrocitai, išskirti iš 30-metės, sergančios paskutine tuberkuliozės stadija. Sukurtas audinys buvo persodintas, pakeičiant šios moters pažeistą kairįjį bronchą. Buvo pažymėta, kad iškart po operacijos persodintas organas pradėjo funkcionuoti ir pagerino pacientės būklę. Praėjus 4 mėnesiams, sukurtas transplantas atliko natyvios trachėjos funkcijas. Svarbu paminėti, kad nebuvo gaminami antikūnai prieš donoro audinį ir nepasireiškė atmetimo reakcija. Šio organo sukūrimas truko apie tris mėnesius, o tai rodo, kad ši technologija nėra tinkama pacientams, kuriems reikalinga skubi transplantacija. Prieš keletą metų, ta pati mokslininkų grupė paskelbė, kad jie sutrumpino transplanto kūrimo laiką iki trijų savaičių, pagerindami donoro trachėjos nuląstelinimo procesą. Galima manyti, kad ateityje audinių inžinerijos būdu sukurtos trachėjos bus plačiau panaudojamos klinikinėje praktikoje (Baiguera ir kt., 2010).

Plaučiai

Lėtinė obstrukcinė plaučių liga (sutr. LOPL) – progresuojanti kvėpavimo takų liga, sutrikdanti jų pralaidumą, dujų apykaitą. Jai būdinga nenormali plaučių uždegiminė reakcija į įkvepiamas kenksmingas daleles ar dujas. Liga pasireiškia nuolatine kvėpavimo takų obstrukcija, plaučių audinio ir kraujagyslių uždegimu, kuris paūmėdamas ilgainiui sukelia negrįžtamus pokyčius – bronchų deformaciją, plaučių fibrozę, emfizemą, kvėpavimo nepakankamumą (Hurst ir kt., 2010). Šia liga dažniausiai suserga vyresnio amžiaus žmonės, dažniau vyrai (Hind ir Maden, 2011). 

Nustatyta, kad pagrindinės  LOPL vystymosi priežastys yra rūkymas ir senėjimas. Be to, ligą gali lemti genetiniai veiksniai. Alfa-1 antitripsino (AAT) baltymas, aptinkamas plaučiuose, padeda apsaugoti juos nuo pažeidimų. Genetinės mutacijos, lemiančios AAT trūkumą, paspartina emfizemos bei LOPL vystymąsi (Tuder ir kt., 2010). 

Plaučiuose MKL pagamintas užląstelinis matriksas gali pagerinti epitelio ląstelių vientiso sluoksnio sudarymą, sustiprinti prigijimą, pagerinti augimą. Be to, MKL sekretuotos tirpios molekulės taip pat kuria pro-regeneracinį parakrininį efektą (Akram ir kt., 2013).

Sukūrus tikslų, natyvų alveolinio plaučių audinio in vitro modelį, būtų galima išsiaiškinti, kokiais būdais MKL gali prisidėti prie epitelinio audinio reparacijos ir ištirti proteolizinio pažeidimo įtaką regeneracijai. Šių mechanizmų supratimas leistų pagerinti šiuo metu kuriamus gydymo MKL metodus bei numatyti naujų galimybių LOPL citoterapijų vystymui.

Plaučių regeneracijos patogeniniai mechanizmai ir MKL poveikis plačiai studijuoti gyvūnų modeliuose. Įrodyta, kad cigarečių dūmų arba kasos elastaze sukelta pelių plaučių emfizema sėkmingai buvo gydoma MKL. Shigemura su bendraautoriais įrodė (2006 m.), kad po MKL terapijos graužikų plaučiuose sumažėjo alveolinių ląstelių apoptozė ir emfizema. Pelių modeliuose KČ MKL terapinis poveikis įrodytas stebint sumažėjusį prouždegiminių citokinų lygį, epitelio augimo veiksnių lygio padidėjimą. MKL išskirti priešuždegiminiai mediatoriai, tokie kaip hepatocitų augimo faktorius (HGF)  stimuliavo alveolių augimą (Gotts ir kt., 2013).

MKL poveikis buvo tiriamas klinikinėje studijoje. 62 pacientai, sergantys pažengusios formos LOPL, buvo gydomi MKL. Pirmieji rezultatai patvirtino, kad preparatas yra saugus; nustatytas mažesnis uždegimo žymens, C – reaktyvaus baltymo (CRB), kiekis. Tačiau, praėjus šešiems mėnesiams nebuvo pastebėta plaučių funkcijos pokyčių (Lau ir kt., 2012). Manoma, kad uždegiminė aplinka riboja plaučių regeneraciją. Ištirta, kad emfizemos pradžia ir progresavimas yra glaudžiai susiję su uždegiminių ląstelių ir mikroorganizmų sankaupomis. Dėl to didėja proteolizė ir mažėja antiproteazinis aktyvumas. LOPL ir būtent emfizeminio jos komponento pažeistas plaučių audinys prastai regeneruoja. Stebimas ląstelių (epitelio ir endotelio) sluoksnio vientisumo netekimas, ląstelių nusilupimas ir net visiškas bazinės membranos apnuoginimas (Hind ir Maden, 2011). 

Kepenys

Kepenų disfunkciją gali sukelti įvairūs insultai, virusinės infekcijos, alkoholis, chirurginės navikų pašalinimo operacijos, vaistų sukeltas ūmus kepenų nepakankamumas. Šiuo metu kepenų sutrikimams gydyti dažniausiai atliekama kepenų transplantacija. Tačiau šios terapijos efektyvumą riboja donorų trūkumas, taip pat reikalinga ilgalaikė imunosupresinė terapija. Ląstelių terapija, siekiant gydyti kepenų sutrikimus, galėtų tapti potencialia išeitimi. Šiuo atveju remiamasi tuo, kad kepenys pasižymi itin dideliu regeneraciniu potencialu in vivo, dėl to, galima manyti, jog tinkamoje aplinkoje galima padauginti kepenų ląsteles iki pakankamo kiekio in vitro ir jas panaudoti audinių inžinerijai (Atala, 2012).  

Buvo išbandyta daug technologijų, kurių metu buvo atrinktos optimaliausios auginimo sąlygos – išbandytos specializuotos auginimo terpės, kokultūros su kitų tipų ląstelėmis, nustatyti proliferacijai reikalingi augimo veiksniai, taip pat bioreaktoriuose tikslinės ląstelės augintos ant tridimensinių karkasų (Atala, 2012).

Prieš keletą metų Baptista su kolegomis aprašė sukurtą tridimensinį, kraujagyslių tinklą turintį natūralų kepenų karkasą (Baptista ir kt., 2011). Įvairių gyvūnų kepenys buvo paveikiamos detergentų tirpalais, siekiant pašalinti ląstelinius audinio komponentus, paliekant tarpląstelinį užpildą ir kraujagyslių tinklą. Nuląstelintas kraujagyslių tinklas gebėjo atlaikyti skysčio srovę. Šis funkcionalus tinklas buvo panaudotas kepenų karkasą užsėjant žmogaus vaisiaus kepenų ir endotelio ląstelėmis, kurios susitelkė tinkamoje nuląstelinto organo natūralioje aplinkoje ir turėjo tipinius endotelio, kepenų ir tulžies epitelio žymenis, taip sukuriant į kepenis panašų audinį in vitro. Tokie rezultatai rodo didžiulę pažangą, kuriant visą organą. Tokios vystomos technologijos leis sukurti pirmąsias pilnai funkcionuojančias kepenis, skirtas organo tranplantacijai (Atala, 2012). 

Kraujodara

Hematopoetinių KL transplantacija (HKLT) klinikoje naudojama kraujodaros atstatymui pacientams po mieloabliacinės ar nemieloabliacinės radioterapijos ar chemoterapijos. Kaulų čiulpų bei jose esančių KL transplantacija tradiciškai taikoma įvairių hematologinių susirgimų, dažniausiai onkohematologinių, gydymui. Jau keletą dešimtmečių tiriamos galimybės transplantuoti iš kaulų čiulpų išskirtas HKL ligoniams sergantiems ūmiomis, kitoms terapijos nepasiduodančiomis, autoimuninių ligų formomis. Dėl potencialo diferencijuotis į visus, tiek mieloidinių, tiek limfoidinių linijų, kraujo ląstelių tipus, HKL naudojamos kraujodaros bei defektyvios imuninės sistemos atstatymui. Transplantacijai HKL gali būti išskiriamos iš kaulų čiulpų punktato arba iš periferinio kraujo, pastaruoju atveju KL iš kaulų čiulpų į periferinį kraują mobilizuojamos ciklofosfamidu bei granuliocitų kolonijas stimuliuojančiu faktoriumi (G-CSF). Dažniausiai transplantuojama visa išskirtų mononuklearinių ląstelių frakcija, arba tik teigiama CD34+ ekspresuojančių selekcija atrinktos HKL. 

Pažanga užtikrinant procedūros saugumą leido HKLT tapti klinikine praktika jau nuo 1995 metų ir autoimuninėmis ligomis sergantiems pacientams, kuriems taikyta HKLT, daugiausia sergantiems išsėtine skleroze, sistemine skleroze, sistemine raudonąja vilklige, reumatoidiniu artritu bei vaskulitais. Dėl teigiamo MKL poveikio kraujodaros atstatymui pacientams po mieloabliacinės radioterapijos ar chemoterapijos, gerokai prasiplėtė jų panaudojimo klinikinėje praktikoje galimybės. Manoma, kad tokia terapija gali sėkmingai sumažinti transplantato prieš šeimininką ligą (GvHD) po hematopoetinių KL transplantacijos (Weng ir kt., 2010). Kartu su HKL transplantavus MKL HLA-identiškiems broliams / seserims, sumažėjo ūmi ir lėtinė transplantato prieš šeimininką liga (Lazarus ir kt., 2005). Be to, tokia kotransplantacija labai pagerino kraujodaros atsikūrimą tiek autologinių, tiek alogeninių transplantacijų metu. Šiuo aspektu itin efektyvi buvo virkštelės kraujo KL transplantacija, kai donorai buvo tiek haploidentiški, tiek negiminingi (Fibbe ir kt., 2003). Transplantuotos kaulų čiulpų haploidentiškos MKL pasižymėjo ryškiu imunosupresiniu veikimu ir ilgalaikiu stipriu teigiamu efektu pacientui net su ūmia IV stadijos šeimininko prieš transplantatą sąveikos reakcija (Le Blanc K ir kt., 2004). 

Taigi nuolat auga susidomėjimas MKL poveikiu alogeninių HKLT metu, kurių aktualiausi yra kraujodaros kamieninių ląstelių prigijimo skatinimas, „transplantanto prieš šeimininką“ ligos profilaktika ir gydymas (Kim ir kt., 2013). MKL pradėta naudoti ir mišraus chimerizmo protokoluose, kai vienu metu išlieka tiek recipiento, tiek donoro kraujodaros ląstelės. Apskritai, MKL terapinis potencialas gydant kraujodaros ligas buvo tiriamas daugybės klinikinių studijų metu ir rezultatai atrodo daug žadantys, nors šiandien dar išlieka neatsakytų klausimų apie jų poveikio mechanizmus (Kim ir kt., 2013).

Inkstai

Nors inkstas buvo pirmasis pakeistas į dirbtinį ir sėkmingai transplantuotas organas (Mirrell ir kt., 1956), dabartiniai gydymo būdai nėra pakankamai efektyvūs. Inkstų audinys laboratorinėmis sąlygomis yra vienas sudėtingiausiai atkuriamų audinių. Inkstai yra labai kompleksiška ir unikali struktūra ir dėl juose esančių ląstelių įvairovės susiduriama su daug sunkumų. Nefronų sistema ir kanalai yra sudaryti iš daugybės funkcionaliai ir morfologiškai skirtingų segmentų. Dėl to, norint užtikrinti ilgalaikį daugelio tipų ląstelių išgyvenamumą, diferenciaciją ir augimą tuo pačiu metu, turi būti parinktos tinkamos sąlygos. Kuriant inkstų audinį daugiausia bandymų atlikta siekiant parinkti patikimą ląstelių šaltinį (Lin ir kt., 2005). Be to, buvo siekiama parinkti optimalias ląstelių auginimo sąlygas, kad sukurtame audinyje inkstų ląstelės galėtų daugintis (Atala, 2012).

Inkstų sutrikimams gydyti galėtų būti pritaikyta ląstelių terapija, kuomet būtų išskirti tinkami ląstelių tipai, produkuojantys specifinius veiksnius, pavyzdžiui, eritropoeitiną gaminančios ląstelės, kurios galėtų būti pritaikytos anemijos formoms, išsivysčiusioms dėl inkstų sutrikimų, gydyti (Aboushwareb ir kt., 2008). Kitais gydymo būdais siekiama pakeisti visą funkcionalų inkstą. Visgi, norint sukurti inksto audinį, atliekantį tikslines funkcijas, būtina panaudoti visų nefroną sudarančių ląstelių tipus. Labai intensyviai ieškota optimalių auginimo sąlygų, kurioms esant šių tipų ląstelės augtų ir išlaikytų savo savybes (Lanza ir kt., 2002). Klonuotos ląstelės, gautos branduolio pernešimo būdu, užsėtos tridimensinėje aplinkoje, geba atkurti inksto struktūras (Atala, 2012).

Vienos studijos metu buvo išskirtos pelės inkstų ląstelės, pagausintos ir užsėtos ant cilindro formos įrenginio, pagaminto iš polikarbonato. Šis prietaisas viename gale sujungtas su kateteriu ir rezervuaro indu. Tuomet jis implantuotas į čiobrialiaukės neturinčių pelių poodį. Tyrimų rezultatai parodė, kad šiame įrenginyje vyko vaskuliarizacija, tai pat formavosi glomerulos, organizuotos į tubules panašios struktūros, taip pat pastebėtos naujai besiformuojančio užląstelinio užpildo struktūros. Be to, skystis, surinktas rezervuare, buvo geltonas ir jo sudėtyje nustatyta 66 mg/dL šlapimo rūgšties. Tai rodo, kad šios struktūros geba gaminti šlapimo rūgštį. Taip pat rezultatai parodė, kad pavienės daugialąstelinės struktūros ląstelės gali tapti organizuotomis į funkcionalius inkstų vienetus, gebančius išskirti pakankamą kiekį į šlapimą panašaus skysčio (Atala, 2012).

Norint nustatyti, ar inkstų audinys galėtų būti suformuotas iš alternatyvių ląstelių šaltinių, buvo atlikta branduolinė transplantacija (terapinis klonavimas) generuojant suderinamumu pasižyminčius audinius ir po to atlikti eksperimentai in vivo. Branduoliai iš jaučio odos fibroblastų buvo perkelti į neapvaisintas donorinės karvės kiaušialąstes. Po to iš klonuotų embrionų išskirtos inkstų ląstelės, pagausintos ir užsėtos ant tridimensinio inkstų karkaso ir po 12 savaičių implantuotos atgal tam pačiam jaučiui, kurio fibroblastai buvo panaudoti studijai. Proceso metu susidarė funkcionalūs inkstų segmentai. Buvo parodyta, kad po transplantacijos, šlapimas susidarė. Tyrimai parodė, kad taip pat susidarė ir glomerulos ir tubulinės struktūros (Atala, 2012). 

Tokie tyrimai rodo, kad ląstelės, gautos branduolio pernešimo būdu, gali būti sėkmingai išskirtos, pagausintos ir persodintos in vivo, panaudojant biodegraduojančius karkasus, ant kurių užsėtos ląstelės gali atkurti audinio struktūras, identiškas šeimininko. Tai buvo pirmosios studijos, kuriomis parodyta, kad terapinis klonavimas gali būti panaudotas audinių regeneracijai in vivo.

Šlapimo pūslė

Siekiant atkurti šlapimo pūslės sienelės komponentus, buvo panaudoti alogeniniai nuląstelinti šlapimo pūslės karkasai. Šie karkasai paruošti mechaniniais ir cheminiais metodais pašalinant visus šlapimo pūslės sienelėje esančius ląstelinius komponentus (Wefer ir kt., 2001; Atala, 2012a). Tačiau daugelyje tyrimų, kuriuose panaudojamos transplantacijai skirtos įvairios medžiagos (neapląstelintos), buvo parodyta, kad urotelinis sluoksnis gebėjo normaliai regeneruoti, bet raumeninis – iki galo neišsivystė (Zhang, 2008).

Kuriant tridimensines struktūras in vitro, manoma, kad bus palengvinta ląstelių diferenciacija po implantacijos in vivo ir taip sumažės uždegiminis atsakas ir bus išvengta implanto atmetimo reakcijos.

Apląstelinti alogeniniai šlapimo pūslės karkasai buvo panaudoti siekiant padidinti šlapimo pūslę šunų modelyje (Atala, 2012). Regeneruoti šlapimo pūslės audiniai buvo sudaryti iš normalią ląstelių organizaciją turinčio urotelio ir lygiųjų raumenų. Nustatytas patikimas (100 %) šlapimo pūslės talpos padidėjimas, naudojant apląstelintus karkasus, lyginant su neapląstelintais (30 %) (Atala, 2012a).

Pirmą kartą šlapimo pūslės rekonstrukcinė operacija žmonėms buvo atlikta 1998 metais. Buvo aprašytas 7 pacientų bandomasis tyrimas, kai buvo panaudotas kolageno karkasas arba kombinuotas PGA-kolageno karkasas, ant kurių užsėtos ląstelės. Pastebėta, kad pacientams, kuriems buvo implantuota šlapimo pūslė iš apsėto PGA-kolageno karkaso, buvo mažesnis spaudimas šlapimo pūslėje, didesnė jos talpa ir ilgesnis šlapimo sulaikymas (Atala ir kt., 2006). Tyrimai ir toliau tęsiami ieškant būdų kurti saugius organus, kurie galėtų būti implantuoti. 

Šlaplė

Per daugelį metų yra sukurta įvairių metodų, kuriais siekiama regeneruoti šlaplės audinį. Vienas tokių išbandytų įvairiuose gyvūnų modeliuose – panaudojant iš PGA pagamintą karkasą, apsėjant ląstelėmis arba ne (Atala, 1992). Natūraliai kolageno turinčios medžiagos (pavyzdžiui, beląstelis šlapimo pūslės) ar šlaplės pogleivis taip pat buvo pritaikyti eksperimentiniuose gyvūnų modelių šlaplės rekonstrukcijos tyrimuose (Chen ir kt., 1999). Šlapimo pūslės pogleivio karkasas galėtų būti tinkamas transplantatas norint atstatyti šlaplės sutrikimus. Naujai sukurti šlaplės audiniai buvo sudaryti iš normalaus urotelio sluoksnio ir raumenų pluoštų. Tokie gauti rezultatai buvo patvirtinti ir klinikiniuose tyrimuose, kuomet pacientams, turintiems šlaplės sutrikimų, rekonstrukcinės operacijos buvo atliktos šiuos sutrikimus atstatant panaudojus žmogaus šlapimo pūslės beląstelius kolageno karkasus (Atala, 2012a). Inžinerijos būdu sukurti šlaplės audiniai anatomiškai buvo panašūs į natyvų šlaplės audinį. Šlaplės ilgis variavo nuo 5 iki 15 cm. Praėjus trejiems metams, trims pacientams iš keturių, ji atliko savo funkciją. Beląstelio kolageno pagrindu sukurtų karkasų panaudojimas šlaplės transplantacijoms padėtų atsisakyti chirurginių procedūrų, todėl potencialiai sumažėtų operacinis laikotarpis ir galimas sergamumo lygis.

Panašūs rezultatai gauti ir kitoje studijoje gydant šlaplės struktūros pakitimų turinčius vaikus ir suaugusius pacientus, panaudojant tokius pat kolageno pagrindu kurtus karkasus (El Kassaby ir kt., 2008). Pastaruoju metu daugiau nei 200 pacientų, sergančių šlaplės ligomis, buvo sėkmingai pagydyti, pritaikant audinių inžinerijos būdu sukurtus šlapimo pūslės ar minėtus kolageno turinčius karkasus. Eksperimentiniuose ir klinikiniuose tyrimuose šlaplės atstatymui buvo sėkmingai pritaikytos abi metodikos, panaudojant neapsėtus beląstelius karkasus. Tačiau eksperimentiniuose tyrimuose bandant atkurti šlaplės kanalų audinius nebuvo gautas atitinkamas šlaplės regeneracijos lygis – atsirado komplikacijų (susiformavo susiaurėjimų ir pan.). Klinikiniai tyrimai, kuriuose šlaplės susiaurėjimų reparacijai panaudoti mažojo žarnyno puriojo jungiamojo audinio sluoksnio kanalėliai, atlikti aštuoniems pacientams. Dviem iš jų, kuriems pasireiškė nedidelis uždegimas, išliko šlaplės kanalo praeinamumas. Kitiems susiaurėjimas pasikartojo per tris mėnesius po operacijos. Taigi manoma, jog neapsėti karkasai gali būti panaudoti siekiant pakeisti trumpus šlaplės segmentus. Tačiau, jei reikalinga šlaplės kanalo reparacija, šie karkasai turi būti apsėti autologinės kilmės ląstelėmis siekiant išvengti kanalų siaurėjimo susidarymo ir audinio neišsivystymo (Atala, 2012). 

Pastaraisiais metais parodyta, kad šlaplės rekonstrukcijai gali būti panaudotos ir sintetinės biomedžiagos, kai suformuojami kanalėliai ir užsėjamos autologinės kilmės ląstelės (Raya–Rivera ir kt., 2011). Buvo sukurti PGA-PLGA karkasai, kurie buvo apsėti autologinėmis ląstelėmis, išskirtomis iš paciento šlapimo pūslės biopsijų. Tokie ląstelėmis apsėti karkasai buvo panaudoti penkiems berniukams jų šlapimo pūslės defektams atstatyti. Nustatyta, kad pacientams laikotarpiu po operacijos šlapimo tėkmės greitis atsistatė ir cistouretrogramų rezultatai parodė, jog pacientams išliko platus šlaplės diametras. Šlaplės biopsijų rezultatai parodė, kad transplantantai buvo sudaryti iš normalią šio audinio struktūrą sudarančių šlaplės ir raumeninio audinių (Atala, 2012).

Genitalijų audiniai ir organai

Įvairioms varpos patologijoms (karcinoma, trauma, erekcijos sutrikimai, įgimti sutrikimai) reikalinga rekonstrukcinė chirurgija. Kai kuriais atvejais gali būti pasirenkama rekonstrukcija autologiniais audiniais, gautais iš paties paciento ląstelių (Atala, 2012a). 

Vienas didžiausių komponentų, sudarančių vyrišką lytinį organą, yra lygieji raumenys. Pirmieji eksperimentai, kuriuose buvo auginamos šių raumenų ląstelės, parodė, jog jos gali būti panaudotos, jas užsėjant ant biodegraduojančių polimerų, norint sukurti akytkūnio audinį de novo (Kershen ir kt., 2002). Siekiant įvertinti sukurto akytkūnio funkcines savybes, buvo panaudoti nuląstelinti kolageno karkasai iš triušio varpos ir išskirtos autologinės akytkūnio lygiųjų raumenų bei endotelio ląstelės, jos pagausintos ir užsėtos ant minėto karkaso. Pastebėta, kad užsėtos ląstelės buvo įsiterpusios į akytkūnio karkaso ertmę. Funkcinės ir struktūrinės savybės stebėtos histologiniais, imunohistocheminiais, imunofermentiniais metodais po implantacijos praėjus šešiems mėnesiams. Sukurtas akytkūnis atitiko struktūrinius ir funkcinius parametrus (Kwon ir kt., 2002). Ši technologija pasitvirtino, kai visas triušio lytinis organas buvo pašalintas ir pakeistas sukurtu karkasu. Vertinant gyvūno aktyvumą, nustatyta, kad šis organas normaliai funkcionavo praėjus vienam mėnesiui po implantacijos. Aktyvumas patvirtintas triušių poravimosi metu visoje tiriamojoje triušių grupėje nustatant spermos išsiskyrimą. Triušių patelės po poravimosi su implantuotais patinėliais susilaukė sveikų palikuonių. Tai rodo, jog varpos akytkūnio audinys gali būti sukurtas audinių inžinerijos metodais, tačiau reikia atlikti daugiau tyrimų, kad būtų įrodytas ilgalaikis sukurto organo funkcionalumas. Be to, reikalingos tolimesnės studijos šią technologiją norint pritaikyti žmogaus lytinių organų struktūrų sukūrimui. 

Moterų genitalijų ir reprodukcinių audinių įgimtos malformacijos gali būti klinikiškai reikšmingos. Buvo bandyta sukurti funkcionalų gimdos audinį, naudojant autologines ląsteles (Atala, 2012a). Buvo išskirtos autologinės triušio patelės lygiųjų raumenų ir epitelio ląstelės, užaugintos ir pagausintos kultūroje. Vėliau šios ląstelės buvo užsėtos ant gimdos formą atitinkančio biodegraduojančių polimerų karkaso ir suformuotas autologinis gimdos audinys, skirtas pakaitai. Praėjus 6 mėnesiams po implantacijos, tyrimų rezultatai parodė, kad susiformavo gimdos audinio komponentai. Sukurtas audinys biomechaninėmis ir funkcinėmis savybėmis buvo panašus į normalų gimdos audinį (Atala, 2012). 

Yra nustatyta patologinių sutrikimų, kurie gali paveikti normalios vaginos vystymąsi arba anatomiją. Vaginalinė rekonstrukcija yra vienas didžiausių iššūkių kuriant audinį, panašų į natyvų. Pirmiausia eksperimentai vykdyti su laboratoriniais gyvūnais, kuomet buvo tiriamos galimybės panaudoti ląstelių kultūras, siekiant sukurti vaginą. Autologinės lygiųjų raumenų ir vaginos epitelio ląstelės buvo išskirtos iš triušio patelių, augintos ir pagausintos kultūroje. Šios ląstelės buvo užsėtos ant biodegraduojančio karkaso ir konstruktas implantuotas pelei. Funkciniai konstrukto tyrimai parodė, jog savybėmis jis panašus į normalų vaginalinį audinį. Šie tyrimai rodo, kad regeneracinės medicinos metodai gali būti pritaikomi klinikinėje praktikoje, rekonstruojant vaginos audinį ateityje (Atala, 2012; Atala, 2012a). 

Oda

Kaip yra žinoma, oda yra didžiausias žmogaus organas. Šio organo pagrindinės funkcijos yra: (1) apsauginė (nuo radiacijos, taip pat fizikinių, biologinių, cheminių medžiagų poveikių), (2) kūno temperatūros reguliacija, (3) vitamino D gamyba, (4) jutiminė. Be to, galima teigti, jog oda yra tam tikras audinių ir organų karkasas. Pavyzdžiui, pažeidus odą, trombinas fibrinogeną sukarpo iki fibrino, kuris kartu su trombocitais, kraujo ląstelėmis bei kitokiomis medžiagomis (tokiomis, kaip fibronektinas) suformuoja krešulį, kuris atlieka „karkaso“ funkciją prisitvirtinant kitoms ląstelėms (Baddour ir kt., 2012).

Taip pat pažeidus odą, keratinocitai atpalaiduoja IL-1 ir naviko nekrozės veiksnį (TNF-α). Makrofagai, neutrofilai, T ląstelės ir trombocitai susitelkia pažeistoje vietoje ir kartu su joje likusia ląstelių populiacija produkuoja augimo veiksnius, kurie ypač svarbūs žaizdos gijimo procesui. Tokie augimo veiksniai yra EGF, TGF-β, PDGF, įvairūs uždegiminiai citokinai. Galiausiai prasideda reepitelizacijos procesas – keratinocitų proliferacija. Kai kuriais atvejais visiškai odos regeneracijai reikalinga kitų epidermio komponentų regeneracija, kurie taip pat gali būti pažeisti. Šiame procese dalyvauja endotelio ląstelės ir fibroblastai (Mahdavian Delavary ir kt., 2011). Buvo įrodyta, jog odoje esančios T ląstelės atlieka ypač daug funkcijų infekcijos, piktybinių navikų, uždegimo, epitelio palaikymo ir reparacijos procesuose (Nestle ir kt., 2009). Epidermio ląstelių subpopuliacija (dendritinės epidermio T ląstelės) ekspresuoja T-ląstelių antigeno receptorių, gyjant žaizdai atlieka labai daug specifinių funkcijų, galimai atpažįsta specifinius žaizdoje išlikusių keratinocitų antigenus. T ląstelės gamina keratinocitų augimo veiksnį, reikalingą keratinocitų proliferacijos procesui.

Greitas ir efektyvus nudegimo žaizdos „užtraukimas“– vienas svarbiausių odos nudegimų gydymo aspektų, kadangi gydymo metu pacientams su tokiais odos pažeidimais yra užtikrinamos tik subseptinės sąlygos iki tol, kol visi odos defektai visiškai užgyja. Tačiau, esant dideliems nudegimų plotams, transplantacijų procedūroms atlikti trūksta donorinių audinių (Kamolz ir kt., 2006).

Pastaruoju metu vis dažniau labai pažeistam odos audiniui gydyti yra panaudojama dirbtinai sukurta oda. Karkasai, pagaminti iš skirtingų matrikso sluoksnių, padeda reguliuoti ir palaikyti ląstelių gebėjimą proliferuoti ir diferencijuoti, kas lemia odos regeneracijos proceso eigą. KL terapijos ir audinių inžinerijos panaudojimas ateityje galėtų tapti alternatyvus gydymo būdas nudegimų ir kitų odos ligų gydymui. 

Kolagenas yra vienas svarbiausių žmogaus jungiamųjų audinių komponentų. Daugelį metų porėti kolageno karkasai buvo naudojami odos, kremzlės, kaulų ir nervų audinių inžinerijoje. Kolagenas plačiai naudojamas odos inžinerijoje, taip pat manoma, jog jis viena perspektyviausių medžiagų, kuri gali būti panaudota įvairiose srityse. Vėliau odos pažaidų reparacijai sukurti biodegraduojantys hialurono rūgšties ir želatinos pagrindo karkasai. Imituojant odos sluoksnius, ant karkasų buvo užsėti žmogaus epidermio keratinocitai, melanocitai ir odos fibroblastai. Imunofluorescencinės analizės rezultatai parodė, jog susiformavo natyvią odos struktūrą atitinkantys odos sluoksniai, kolageno kiekis buvo 50 % didesnis nei ląstelėse, augintose monosluoksnėje kultūroje. In vivo tyrimų histologinės analizės rezultatais parodyta, kad karkasai pagerino odos žaizdų gijimą, sumažino neutrofilų infiltratų skaičių, o naujai atkurta oda sustorėjo, lyginant su pacientų grupe be gydymo (Wang ir kt., 2013).

Buvo parodyta, kad kaulų čiulpų KL, taip pat iš periferinio kraujo išskirti fibrocitai gali būti panaudoti epitelio reparacijai. Fibrocitai, diferencijuodami į miofibroblastus mažina fibrozę. Taip pat buvo parodytas KČ MKL potencialas diferencijuoti į epidermio ląsteles ir fibroblastus in vitro, o audinių inžinerijos metodais sukurto karkaso panaudojimas gali pagreitinti odos pažeidimų reparacijos procesą in vivo. Tai įrodo audinių inžinerijos ir MKL panaudojimo ir pritaikymo galimybes, bandant sukurti odos audinį. Po odos pažeidimo, ankstyvojoje uždegimo stadijoje KL migruoja į pažeidimo vietą, reguliuoja epitelio ir odos KL proliferaciją. Jos ekspresuoja IL-1 receptorių antagonistus ir inhibuoja uždegiminį ir imuninį atsakus (Kim ir kt., 2007).

Neseniai atliktų tyrimų rezultatai rodo, kad hematopoetinės KL taip pat diferencijuoja į ektodermos, mezodermos ir endodermos audinių ląsteles. Kultūroje užaugintas epidermis klinikinėje praktikoje buvo panaudotas kaip transplantatas gydant įvairius nudegimus, odos opas ir burnos gleivinės defektus. Toks gydymo būdas sulaukė gana daug dėmesio gydant rimtus nudegimus, kadangi atsirado galimybė transplantuoti pakankamai didelį epitelio paviršių. Žmogaus virkštelės kraujas – tai vienas alternatyvių KL šaltinių ir jos gali būti panaudotos tiek vaikų, tiek suaugusių pacientų ligų gydymui. Virkštelės kraujo paėmimo procedūra nesudėtinga, saugi ir neskausminga. Šios ląstelės labai plačiai taikomos hematologinių ligų gydymui. Kamolz mokslininkų grupė nustatė, kad iš virkštelės kraujo išskirtos KL geba diferencijuoti į keratinocitus in vitro sąlygomis (Kamolz ir kt., 2006). Dar viena mokslininkų grupė nustatė, jog R–KL gali skatinti žmogaus odos fibroblastų proliferaciją ir odos reepitelizaciją jos pažeistose vietose (Kim ir kt., 2007). Patekusios į pažeistą odos vietą R–KL prigyja ir išgyvena in vivo sąlygomis, spontaniškai diferencijuoja į kraujagyslių endotelio, fibroblastų ir epidermio epitelio ląsteles ir žymiai pagerina žaizdos gijimo procesą. 

Kaulai ir kremzlė

Sergamumas reumatinėmis ligomis yra itin didelis. Dažniausiai šios ligos yra nepagydomos, skausmingos, sukeliančios ankstyvą negalią (Monjardino ir kt. 2011). Viena iš dažniausiai diagnozuojamų sąnarių ligų yra reumatoidinis artritas (RA). Reumatoidinis artritas yra lėtinė, sisteminė nuolat progresuojanti liga, kuriai būdingi sąnarių skausmai, sustingimas ir progresuojanti funkcinė negalia. Pasaulio sveikatos organizacijos duomenimis, reumatoidiniu artritu serga 1–2 % žmonių. Sergantiesiems reumatoidiniu artritu lėtinis, nuolat paūmėjantis sinovitas pažeidžia sąnarių kapsulę, raiščius ir raumenis. Skausmas, sustingimas, sutrikusi sąnarių biomechanika, raumenų atrofija bei blogas fizinio krūvio toleravimas palaipsniui mažina sergančiųjų fizinį aktyvumą (Tamulaitienė ir kt. 2012).

Dažniausia, su amžiumi susijusi degeneracinė, lėtai progresuojanti, nežinomos etiologijos sąnarių liga yra osteoartritas (OA). Ja serga daugiau nei 12 % žmonių, sulaukusių daugiau nei 60 metų amžiaus (Jorgensen ir Noël, 2011). Vakarų šalyse 7–18 % vyresnio amžiaus žmonių stebimas simptomatinis kelio sąnario osteoartritas. Epidemiologiniais tyrimais nustatyta, kad osteoartrito rizikos veiksniai yra amžius, nutukimas, traumos, profesijos, lytis (Leonavičienė ir kt., 2008). Siekiant sukurti tinkamus metodus, kuriais būtų pakeičiami arba regeneruojami ligų pažeisti ar sužaloti audiniai, kaip minėta, ląstelių terapija ir sąnario audinių inžinerija yra pagrindiniai regeneracinės medicinos komponentai. 

Osteoartrito metu pažeidžiama ne tik kremzlė, bet ir pokremzlinis kaulas, taip pat gali būti pažeista sinovija, raiščiai, sausgyslės, raumenys. Menisko pažeidimas didina osteoartrito riziką. Osteoartrito patogenezėje meniskas biologiškai svarbus, sekretuoja uždegiminius veiksnius ir užpildo degradacijos fermentus. 2012 metais atliktame tyrime in vitro, sinovijos audinys buvo veikiamas MKL, nustatyta sumažėjusi IL-1β, MMP-1, MMP-13 genų raiška. Esant uždegimo sąlygoms, MKL sekretuoja įvairius veiksnius, kurie skatina priešuždegiminį efektą ir kremzlės audinio atsinaujinimą. Kamieninių ląstelių įšvirkštimas tokiems pacientams gali padidinti sąnario kremzlės regeneracijos procesą arba inhibuoti laipsnišką sąnario destrukciją. Keleto tyrimų metu buvo parodyta, kad persodinus MKL į pažeistą kelio sąnarį yra galimybė stimuliuoti kremzlės regeneraciją ir sulėtinti sąnario irimą, kuris vyksta jį pažeidus (Murphy ir kt. 2003). In vivo tyrimų metu buvo parodyta, jog sąnario regeneracijos procesuose didelės reikšmės turi iš sinovijos išskirtos MKL (Tyndal ir van Laar, 2010). Įvairių studijų duomenimis, sąnarių ligų gydymas panaudojant MKL (Van Buul ir kt., 2012) ar R-MKL (Maumus ir kt., 2013) yra daug žadanti terapijos perspektyva. 

Dėl įvairių traumų, rekonstrukcinės chirurgijos, įgimtų defektų, ligų sunyksta ar prarandami dideli kaulinio audinio plotai, todėl vis dar išlieka poreikis ieškoti inovatyvių terapinių galimybių kaulinio audinio regeneracijai. Šiuolaikinėje klinikinėje praktikoje yra taikoma gana daug gydymo strategijų: kaulų transplantacija, dirbtinių kaulų ir augimo veiksnių implantacija, karkasų, apsėtų proliferacinėmis ir diferenciacijos savybėmis pasižyminčiomis kaulinėmis ląstelėmis, panaudojimas (Baddour ir kt., 2012). Klinikinėje praktikoje labai plačiai panaudojami dirbtiniai kaulai, tačiau tokie transplantacijai skirti dirbtiniai audiniai sukelia recipiento imunines ir atmetimo reakcijas. Pastaruoju metu, kuriant biologiškai suderinamą, biodegraduojantį kaulinį audinį klinikiniams tikslams, bandoma pritaikyti genų ir ląstelių terapijos galimybes. Yra kuriami tridimensiniai biodegraduojantys karkasai, ant kurių tiksliniam audiniui atstatyti panaudojamos ląstelės gebėtų proliferuoti ir formuoti užląstelinį užpildą, tikrinamas jų biologinis suderinamumas (Baddour ir kt., 2012).

Kaulinio audinio ląstelės, vadinamos osteocitais, yra diferencijuotos specializuotos ląstelės, gebančios atlaikyti mechaninį poveikį ir padidinti kaulo atsparumą apkrovai. Per visą gyvenimą kaulinis audinys skeleto vystymosi laikotarpiu geba regeneruoti ir skatinti normalų lūžio gijimą, įvykus traumai. Natūralaus kaulo modelyje vyrauja du ląstelių tipai: osteoblastai (MKL kilmės) ir osteoklastai (hematopoetinių KL kilmės). Yra žinoma, kad osteoblastų diferenciaciją kontroliuoja įvairūs veiksniai – IL-11, Wnt, BMP ir kt. Kuomet preosteoblastai diferencijuoja į aktyvius subrendusius osteoblastus, įvyksta jų fenotipiniai pokyčiai, pradedami sintetinti kaulo matrikso baltymai, reikalingi ląstelių galutinei diferenciacijai į osteocitus (Baddour ir kt., 2012). 

Prieš implantuojant MKL, iš pradžių jos pagausinamos in vitro iki reikiamo kiekio. Tiriamos galimybės panaudoti ir kitus ląstelių šaltinius, kurie galėtų būti svarbūs kaulinio audinio regeneracijai. Tai periferinio kraujo ląstelės, riebalinio audinio progenitorinės ląstelės ir raumeninių audinių ląstelės.

Buvo tiriamos galimybės pritaikyti MKL kaulinio audinio reparacijai jas injekuojant lokaliai ir panaudojant sisteminę technologiją, rekombinantinių genų technologiją ir audinių inžineriją. Taip pat buvo panaudoti virusinės ir nevirusinės kilmės vektoriai, siekiant kamieninėse ląstelėse pernešti genus ir juos nukreipti į tikslinę vietą. Be to, bandoma sukurti tridimensinius biodegraduojančius karkasus, kuriuose ląstelės galėtų proliferuoti ir formuoti užląstelinį užpildą, tiriamas jų biologinis suderinamumas. Kaip alternatyva yra analizuojamos biomedžiagų, pagamintų kombinuojant natūralias ar sintetines medžiagas su mikro-/nano- dalelėmis, mechaninės savybės ir gebėjimas formuoti kaulinį audinį bei galimybės jas pritaikyti kaulinio audinio regeneracijai. Prieš keletą metų buvo parodytas bioneorganinių junginių potencialas skatinti kaulo regeneraciją (Habibovic ir Barralet, 2011). Kieti transplantatai paskatino vietinių defektų reparaciją. Yra sukurtos ir į audinius panašios struktūros, kuriose ant tridimensinių karkasų yra užsėjamos ląstelės (pavyzdžiui, MKL) ir veikiant augimo veiksniais suformuojama ir išlaikoma kaulinio audinio struktūra (Baddour ir kt., 2012).

Norint sėkmingai sukurti MKL audinius, reikalinga naudoti augimą ir diferenciaciją skatinančius veiksnius, kuriais būtų indukuojami specifiniai diferenciacijos keliai ir išlaikomi osteocitų ar chondrocitų fenotipai kartu su tinkamomis karkasų kultūromis, palaikoma tridimensinė aplinka (Maumus ir kt. 2011).

Dėl sudėtingos kremzlės struktūros iki šiol jos rekonstrukcija yra vienas sudėtingiausių audinių reparacijos ir regeneracijos atvejų. Siekiant atkurti pažeistą kremzlę, yra bandomi įvairūs biodegraduojantys sintetiniai polimeriniai karkasai, ant kurių užsėjamos KL, kurios stimuliuojamos įvairiais veiksniais, skatinančiais ląstelių adheziją ir proliferaciją (Baddour ir kt., 2012).

Pasitelkus šiuolaikinius gydymo metodus – tiek nemedikamentinius (pratimai, įtaisai, elektroterapija, dieta), tiek gydymą vaistais ir chirurgines intervencijas, buvo sulėtintas reumatoidinio artrito metu vykstantis sąnario destrukcijos procesas. Tačiau regeneruoti RA pažeistą kremzlę išlieka viena pagrindinių užduočių (Tyndal ir van Laar, 2010).

Mezenchiminių kamieninių ląstelių terapija yra vienas iš inovatyviausių būdų gydyti reumatines ligas, dabartiniais gydymo metodais ne visuomet pavyksta visiškai atkurti audinio funkcijas. Klinikiniuose tyrimuose yra stengiamasi įrodyti MKL panaudojimo kremzlinio audinio ir degeneracinio artrito gydymui saugumą, taip pat klinikinį šių ląstelių potencialą autoimuninėms ligoms gydyti (Maumus ir kt., 2013, Jorgensen ir Noël, 2011). Tačiau vis dar nėra sukurta tinkamo sintetinio kaulinio audinio, kuris pasižymėtų panašiomis biologinėmis ir mechaninėmis savybėmis kaip natyvus, todėl išlieka aktualu ieškoti būdų, tinkamų kaulų ir kremzlės audinių regeneracijai ir reparacijai (Baddour ir kt., 2012).

Apibendrinimas

Regeneracinės medicinos vystymosi sparta teikia daug vilčių ateities medicinos eigai, kadangi šioje srityje yra atliekama itin daug eksperimentinių tyrimų vos ne kiekvienam žmogaus audiniui ar organui. Regeneracinė medicina apima daugelį sričių: audinių inžineriją, ląstelės biologiją, genetines manipuliacijas, medžiagų mokslą ir kt. Įvaldžius ląstelių išskyrimo, kultivavimo, pagausinimo, transplantacijos metodus, taip pat polimerų kūrimo technologijas, jas galima sėkmingai pritaikyti siekiant pailginti žmogaus gyvenimo trukmę bei kokybę.

Įvairūs audiniai yra skirtinguose kūrimo etapuose – vieni jau taikomi klinikinėje praktikoje, su kitais yra atliekami klinikiniai tyrimai, o dar kiti tik pradedami kurti, vieniems audiniams tinkamesnės yra iš suaugusių individų audinių išskirtos kamieninės ląstelės, kitais atvejais yra būtinos ankstesnių diferenciacijos stadijų, embrioninės kilmės ar indukuotos pluripotentinės kamieninės ląstelės. Atsižvelgiant į šiandienę audinių inžinerijos ir regeneracijos tyrimų pažangą, galima teigti, jog regeneracinės medicinos principai ateityje gali būti labai plačiai pritaikyti klinikinėje praktikoje visose medicinos srityse.

Literatūra

[1] Aboushwareb T., Egydio F., Straker L., Gyabaah K., Atala A., Yoo J. J. 2008. Erythropoietin Producing Cells For Potential Cell Therapy. World Journal of Urology, 26 (4): 295–300
[2] Akram K., Samad S., Spiteri M., Forsyth N. 2013. Mesenchymal Stem Cells Promote Alveolar Epithelial Cell Wound Repair in vitro Through Distinct Migratory and Paracrine Mechanisms. Respiratory Research, 14 (9): 1–16
[3] Amoabediny G., Nik N. S., Heli B. 2011. The Role of Biodegradable Engineered Scaffold in Tissue Engineering. Biomaterials Science and Engineering, Prof. Rosario Pignatello (Ed.), ISBN: 978-953-307-609-6, In Tech
[4] Andaloussi S. E., Mager I., Breakefield X. O., Wood M. J. 2013. Extracellular Vesicles: Biology and Emerging Therapeutic Opportunities. Nature Reviews Drug Discovery, 12 (5): 347–357 
[5] Atala A, Bauer S. B., Soker S., Yoo J. J., Retik A. B.2006. Tissue Engineered Autologous Bladders for Patients Needing Cystoplasty. Lancet, 367 (9518):1241–1246
[6] Atala A., 2012. Regenerative Medicine Strategies. Journal of Pediatric Surgery, Elsevier 47 (1): 17–28
[7] Atala A., 2012a. Tissue Engineering of Reproductive Tissues and Organs. Fertility and Sterility, 98 (1): 21–29.
[8] Baddour J. A., Sousounis K., Tsoni P. A. 2012. Organ Repair and Regeneration: An Overview. Birth Defects Research (Part C), 96 (1): 1–29 
[9] Baiguera S., Birchall M. A., Macchiarini P. 2010. Tissue–Engineered Tracheal Transplantation. Transplantation, 89 (5): 485–491
[10] Baiguera S., Jungebluth Ph., Mazzanti B., Macchiarini P. 2012. Mesenchymal Stromal Cells for Tissue-Engineered Tissue and Organ Replacements. Transplant International, 25 (4): 369–382
[11] Baptista P. M., Atala A. 2014. Regenerative Medicine: the Hurdless and Hopes. Translational Research, 163 (4): 1–4 
[12] Baptista P. M., Siddiqui M. M., Lozier G., Rodriguez S. R., Atala A., Soker S. 2011. The Use of Whole Organ Decellularization For the Generation of a Vascularized Liver Organoid. Hepatology, 53 (2): 604–617
[13] Baruscotti M., Barbuti A., Bucchi A. 2010. The Cardiac Pacemaker Current, Journal of Molecular and Cellular Cardiology, 48 (1): 55–64
[14] Bunnell B. A., Flaat M., Gagliardi, Patel B., Ripoll C. 2008. Adipose-Derived Stem Cells: Isolation, Expansion and Differentiation. Methods, 45 (2): 115–120
[15] Carpenter EM1, Llamas C, Buck BE, Malinin TI.Induction of neural tissue markers by micronized human spinal cord implants.J Neurosci Res. 2014 Nov 10. (Epub ahead of print) 
[16] Carrel A., Lindbergh C. A. 1935. The Culture of Whole Organs. Science, 81 (2112): 621–623
[17] Cawthorn W. P., Scheller E. L., MacDougald O. A. 2012. Adipose Tissue Stem Cells: the Great WAT Hope. Trends in Endocrinology & Metabolism, 23 (6): 270–277 
[18] Cen L., Liu W., Cui L., Zhang W. Cao Y. 2008. Collagen Tissue Engineering: Development of Novel Biomaterials and Applications. Pediatric Research, 63 (5): 492–496
[19] Chen F., Yoo J. J., Atala A.1999. Acellular Collagen Matrix As a Possible “Off the Shelf” Biomaterial For Urethral Repair. Urology ,54 (3): 407–410
[20] Condic M. L., Rao M. 2010. Alternative Sources of Pluripotent Stem Cells: Ethical and Scientific Issues Revisited. Stem Cells and Development, 19 (8): 1121–1129 
[21] Desando G., Cavallo C., Sartoni F., Martini L., Parrilli A., Veronesi F., Fini M., Giardino R., Facchini A., Grigolo B. 2013. Intra-articular Delivery of Adipose Derived Stromal Cells Attenuates Osteoarthritis Progression in an Experimental Rabbit Model. Arthritis Research & Therapy, 15 (1): 1–15 
[22] Djouad F., Bouffi C., Ghannam S., Noël D., Jorgensen C. 2009. Mesenchymal Stem Cells: Innovative Therapeutic Tools for Rheumatic Diseases, Nature Reviews Rheumatology 5 (7): 392–399
[23] Dominici M., Le Blanc K., Mueller I., Slaper-Cortenbach I., Marini F. C., Krause D. S., Deans R. J., Keating A., Prockop D. J., Horwitz E. M. 2006. Minimal Criteria for Defining Multipotent Mesenchymal Stromal Cells. The International Society for Cellular Therapy Position Statement. Cytotherapy, 8 (4): 315–317 
[24] El Kassaby A., Aboushwareb T., Atala A. 2008. Randomized Comparative Study Between Buccal Mucosal and Acellular Bladder Matrix Grafts in Complex Anterior Urethral Strictures. The Journal of Urology, 179 (4): 1432–1436
[25] Engelman M. G., Franz W. M. 2006. Stem Cell Therapy After myocardial Infarction: Ready For Clinical Application? Current Opinion in Molecular Therapeutics, 8 (5): 396–414
[26] European Cardiovascular Disease Statistics. 2012. http://www.ehnheart.org/cvd-statistics.html (žiūrėta 2014 10 01)
[27] Fibbe WE, Noort WA: Mesenchymal stem cells and hematopoietic stem cell transplantation. Ann N Y Acad Sci 2003; 996: 235-44.
[28] Fomčenko I., Gudlevičienė Ž. 2013. Mezenchiminės kamieninės ląstelės ir jų panaudojimas individualizuotai medicinai. Medicinos teorija ir praktika, 19 (4): 338–345
[29] Fuchs J. R., Hannouche D., Terada S., Vacanti J. P., Fauza D. O. 2003. Fetal Tracheal Augmentation With Cartilage Engineered From Bone Marrow–Derived Mesenchymal Progenitor Cells. Journal of Pediatric Surgery, 38 (6): 984–987
[30] Fuchs J. R., Terada S., Ochoa E. R., 2002. Fetal Tissue Engineering: in utero Tracheal Augmentation in an Ovine Model. Journal of Pediatric Surgery, 37 (7): 1000–1006
[31] Gimble. J. M., Katz A. J., Bunnell B. A. 2007. Adipose-Derived Stem Cells for Regenerative Medicine. Circulation Research, 100 (9): 1249–1260 
[32] Goodman S. B. 2013. Cell-Based Therapies for Regenerating Bone. Minerva Ortopedica Traumatologica, 64 (2): 107–113 
[33] Gotts J. E., Matthay M. A. 2013. Cell Therapy For Lung Disease, Chest, 143 (6): 1525–1527
[34] Habibovic P., Barralet J. E. 2011. Bioinorganics and Biomaterials: Bone Repair. Acta Biomaterialia, 7 (8): 3013–3026
[35] Haynesworth S. E., Baber M. A., Caplan A. I. 1996. Cytokine Expression by Human Marrow-Derived Mesenchymal Progenitor Cells in vitro: Effects of Dexamethasone and IL-1 alpha. Journal of Cellular Physiology, 166 (3): 585–592
[36] Han D., Gouma P. I. 2006. Electrospun Bioscaffolds that Mimic the Topology of Extracellular Matrix. Nanomedicine, 2 (1): 37–41
[37] Hansson EM1, Lendahl U. Regenerative medicine for the treatment of heart disease. J Intern Med. 2013 Mar;273(3):235-45.
[38] Harasymiak-Krzyzanowska I., Niedojadlo A., Karwat J., Kotula L., Gil-Kulik G., Sawiuk M., Kocki J. 2013. Adipose Tissue-Derived Stem Cells Show Considerable Promise for Regenerative Medicine Applications. Cellular & Molecular Biology Letters, 4 (18): 479–493 
[39] Harris L. D., Kim B. S., Mooney D. J. 1998. Open Pore Biodegradable Matrices Formed With Gas Foaming. Journal of Biomedical Materials Research, 42 (5): 396–402
[40] Hind M., Maden M. 2011. Is a Regenerative Approach Viable For the Treatment of COPD?, British Journal of Pharmacology, 163 (1): 106–115
[41] Hurst J. R., Vestbo J., Anzueto A., Locantore N., Mullerova H., Tal-Singer R. 2010. Susceptibility to Exacerbation in Chronic Obstructive Pulmonary Disease. New England Journal of Medicine, 363 (12): 1128–1138
[42] Hwang N. S., Zhang C., Hwang Y. S., Varghese S. 2009. Mesenchymal Stem Cell Differentiation and Roles in Regenerative Medicine. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine, 1 (1): 97–106
[43] Jawad H., Ali N. N., Lyon A. R., Chen Q. Z., Harding S. E., Boccaccini A. R. 2007. Myocardial Tissue Engineering: a Review. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, 1 (5): 327–342
[44] Johnson K., Zhu S., Tremblay M. S., Payette J. N., Wang J., Bouchez L. C., Meeusen S., Althage A., Cho Ch. Y., Wu X., Schultz P. G. 2012. A Stem Cell-Based Approach to Cartilage Repair. Science, 336 (6082): 717–721 
[45] Jorgensen C., Noël D. 2011. Mesenchymal Stem Cells in Osteoarticular Diseases, Regenerative Medicine, 6 (6): 44–51
[46] Jorgensen Ch. 2013. Mesenchymal Stem Cells: Uses in Osteoarthritis. Joint Bone Spine, Elsevier, 80 (6): 565–567 
[47] Kamolz L. P., Kolbus A., Wick N., Mazal P. R., Elsenbock B., Buriak S., Meissl G. 2006. Cultured Human Epithelium: Human Umbilical Cord Blood Stem Cells Differentiate Into Keratinocytes Under in vitro Conditions. Burns: Journal of the International Society for Burn Injuries. 32 (1): 16–19
[48] Kanno H. 2013. Regenerative Therapy for Neuronal Diseases with Transplantation of Somatic Stem Cells. World Journal of Stem Cells, 5 (4): 163–171 
[49] Kershen R. T., Yoo J. J., Moreland R. B., Krane R. J., Atala A. 2002. Reconstitution of Human Corpus Cavernosum Smooth Muscle in vitro and in vivo. Tissue Engineering, 8 (3): 515–524
[50] Kim EJ1, Kim N, Cho SG.The potential use of mesenchymal stem cells in hematopoietic stem cell transplantation. Exp Mol Med. 2013 Jan 10; 45:e2
[51] Kim K, Doi A, Wen B et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature 2010; 467: 285–90.
[52] Kim W. S., Park B. S., Sung J. H., Yang J. M., Park S. B., Kwak S. J., Park J. S. 2007. Wound Healing Effect of Adipose-Derived Stem Cells: a Critical Role of Secretory Factors on Human Dermal Fibroblasts. Journal of Dermatological Science, 48 (1): 15–24
[53] Kwon T. G., Yoo J. J., Atala A. 2002. Autologous Penile Corposa Cavernosa Replacement Using Tissue Engineering Techniques. The Journal of Urology, 168 (4): 1754–1758
[54] Lanza R. P., Chung H. Y., Yoo J. J., Wettstein P. J., Blackwell C., Borson N., Hofmeister E., Schuch G., Soker S., Moraes C. T., West M. D., Atala A. 2002. Generation of Histocompatibile Tissues Using Nuclear Transplantation, Nature Biotechnology, 20 (7): 689–696
[55] Lau A., Goodwin M., Kim C., Weiss D. 2012. Stem Cells and Regenerative Medicine in Lung Biology and Diseases, Molecular Therapy, 20 (6): 1116–1130
[56] Lavoie J. R., Myles-Rosu M. 2013. Uncovering the Secretes of Mesenchymal Stem Cells. Biochimie, 95 (12): 2212–2221 
[57] Lazarus HM, Koc ON, Devine SM, et al.: Cotransplantation of HLA-identical sibling culture-expanded mesenchymal stem cells and hematopoietic stem cells in hematologic malignancy patients. Biol Blood Marrow Transplant 2005; 11(5): 389-98.
[58] Le Blanc K, Rasmusson I, Sundberg B, et al.: Treatment of severe acute graft-versus-host disease with third party haploidentical mesenchymal stem cells. Lancet 2004; 363(9419): 1439-41.
[59] Lee S. J., Liu J., Oh S. H., Soker S., Atala A., Yoo J. J. 2008 . Development of a Composite Vascular Scaffolding System that Withstands Physiological Vascular Conditions. Biomaterials, 29 (19): 2891–2898
[60] Leonavičienė L., Vaitkienė D., Keturkienė A., Bradūnaitė R., Vasiliauskas A. 2008. Eksperimentinis osteoartritas ir jo gydymas augaliniais preparatais. Gerontologija, 9(1): 34–48
[61] Lin F., Moran A., Igarashi P. 2005. Intrarenal Cells, Not Bone Marrow – Derived Cells, Are the Major Source for Regeneration in Postishemic Kidney. The Journal of Clinical Investigation, 115 (7): 1756–1764
[62] Lopatina T1, Kalinina N, Karagyaur M, Stambolsky D, Rubina K, Revischin A, Pavlova G, Parfyonova Y, Tkachuk V. Adipose-derived stem cells stimulate regeneration of peripheral nerves: BDNF secreted by these cells promotes nerve healing and axon growth de novo. PLoS One. 2011:14; 6(3):e17899. 
[63] Macchiarini P., Jungebluth P., Go T., Asnaghi M. A., Rees L. E., Cogan T. A., Dodson A., Martorell J., Bellini S., Parnigotto P. P., Dickinson S. C., Hollander A. P., Mantero S., Conconi M. T., Birchall M. A. 2008. Clinical Transplantation of a Tissue-Engineered Airway. Lancet, 372 (9655): 2023–2030
[64] Mahdavian Delavary B., van der Veer W. M., van Egmond M., Niessen F. B., Beelen R. H. 2011. Macrophages in Skin Injury and Repair. Immunobiology, 216 (7): 753–762
[65] Marini J. C., Forlino A. 2012. Replenishing Cartilage from Endogenous Stem Cells. Clinical Implications of Basic Research, 366 (26): 2522–2524 
[66] Matsui T1, Akamatsu W1, Nakamura M2, Okano H3. Regeneration of the damaged central nervous system through reprogramming technology: basic concepts and potential application for cell replacement therapy. Exp Neurol. 2014 Oct; 260:12-8. 
[67] Matsumura G., Miyagawa–Tomita S., Shin’oka T., Ikada Y., Kurosawa H. 2003. First Evidence That Bone Marrow Cells Contribute to the Construction of Tissue-Engineered Vascular Autografts in vivo. Circulation, 108 (14): 1729–1734
[68] Maumus M, Manferdini C, Toupet K, Peyrafitte JA, Ferreira R, Facchini A, Gabusi E, Bourin P, Jorgensen C, Lisignoli G et al: Adipose mesenchymal stem cells protect chondrocytes from degeneration associated with osteoarthritis. Stem Cell Res 2013, 11(2):834-844.
[69] Maumus M., Guérit D., Toupet K., Jorgensen C., Noël D. 2011. Mesenchymal Stem Cell-Based Therapies in Regenerative Medicine: Applications in Rheumatology. Stem Cell Research & Therapy 2(2): 14
[70] Maumus M., Jorgensen Ch., Noel D. 2013. Mesenchymal Stem Cells in Regenerative Medicine Applied the Rheumatic Diseases: Role of Secretome and Exosomes. Biochimie, 95 (12): 2229–2234 
[71] Merrill J. P., Harrison J. H., Murray J., Guild W. R. 1956. Successful Homotransplantation of The Kidney in an Identical Twin. Transactions of the American Clinical and Climatological Association. 67 (1): 167–173
[72] Mobasheri A. 2013. The Future of Osteoarthritis Therapeutics: Emerging Biological Therapy. Current Rheumatology Reports, 15 (385): 1–9 
[73] Monjardino T., Lucas R., Barros H. 2011. Frequency of Rheumatic Diseases in Portugal: a Systematic Review. Acta Reumatológica Portuguesa, 36 (4): 336–363
[74] Murphy J. M., Fink D. J., Hunziker E. B., Barry F. P. 2003. Stem Cell Therapy in a Caprine Model of Osteoarthritis. Arthritis & Rheumatism, 48 (12): 3464–3474
[75] Murry CE, Keller G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development.Cell 2008; 132: 661–80.
[76] Nestle F. O., Di Meglio P., Qin J. Z. , Nickoloff B. J. 2009. Skin Immune Sentinels in Health and Disease. Nature Reviews. Immunology, 9 (10): 679–691
[77] Nori S, Okada Y, Yasuda A, Tsuji O, Takahashi Y, Kobayashi Y, Fujiyoshi K, Koike M, Uchiyama Y, Ikeda E, Toyama Y, Yamanaka S, Nakamura M, Okano H. Grafted human-induced pluripotent stem-cell-derived neurospheres promote motor functional recovery after spinal cord injury in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011; 108(40):16825–16830 
[78] Ogawa Y, Sawamoto K, Miyata T, Miyao S, Watanabe M, Nakamura M, Bregman BS, Koike M, Uchiyama Y, Toyama Y, Okano H. Transplantation of in vitro-expanded fetal neural progenitor cells results in neurogenesis and functional recovery after spinal cord contusion injury in adult rats. J Neurosci Res. 2002; 69(6):925–933.
[79] Ohnishi S., Nagaya N. 2008. Tissue Regeneration as Next-Generation Therapy for COPD – Potential Applications, International Journal of COPD, 3 (4): 509–514
[80] Okano, Yamanaka. iPS cell technologies: significance and applications to CNS regeneration and disease. Molecular Brain 2014, 7:22  
[81] Ott H. C., Matthiesen T. S., Goh S. K., Black L. D., Kren S.M., Netoff T. I., Taylor D. A. 2008. Perfusion–Decellularized Matrix: Using Nature’s Plattform to Engineer a Bioartificial Heart. Nature Medicine, 14 (2): 213–221
[82] Parker A. M., Katz A. J. 2006. Adipose-Derived Stem Cells for the Regeneration of Damaged Tissues. Expert Opinion on Biological Therapy, 6 (6): 567–578 
[83] Pham C., Greenwood J., Cleland H., Woodruff P., Maddern G. 2007. Bioengineered Skin Substitutes for the Management of Burns: a Systematic Review. Burns, 33 (8): 946–957
[84] Pincus DW, Keyoung HM, Harrison-Restelli C, Goodman RR, Fraser RA, Edgar M, Sakakibara S, Okano H, Nedergaard M, Goldman SA. Fibroblast growth factor-2/brain-derived neurotrophic factor-associated maturation of new neurons generated from adult human subependymal cells.Ann Neurol. 1998; 43(5):576–585
[85] Plotnikov A. N., Shlapakova I., Szabolcs M. J., Danilo P. Jr., Lorell B. H., Potapova I. A., Lu Z., Rosen A. B., Mathias R. T., Brink P. R., Robinson R. B., Cohen I. S., Rosen M. R., 2007. Xenografted Adult Human Mesenchymal Stem Cells Provide a Platform for Sustained Biological Pacemaker Function in Canine Heart. Circulation, 116 (7): 706–713
[86] Porada Ch., Almeida-Porada G. 2010. Mesenchymal Stem Cells as Therapeutics and Vehicles for Gene and Drug Delivery. Advanced Drug Delivery Reviews, 62 (12): 1156–1166. 
[87] Raya-Rivera A., Esquiliano D. R., Yoo J. J., Lopez-Bayghen E., Soker S., Atala A. 2011. Tissue-Engineered Autologous Urethras for Patients Who Need Reconstruction: an Observational Study. Lancet, 377 (9772): 1175–1182
[88] Rosen M. R., Robinson R., Brink P., Cohen I. S. 2004. Recreating the Biological Pacemaker. The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology, 280 (2): 1046–1052
[89] Sakakibara S, Imai T, Hamaguchi K, Okabe M, Aruga J, Nakajima K, Yasutomi D, Nagata T, Kurihara Y, Uesugi S, Miyata T, Ogawa M, Mikoshiba K, Okano H. Mouse-Musashi-1, a neural RNA-binding protein highly enriched in the mammalian CNS stem cell. Dev Biol.1996; 176(2):230–242. 
[90] Salinas C. N., Anseth K. S. 2009. Mesenchymal Stem Cells for Craniofacial Tissue Regeneration: Designing Hydrogel Delivery Vehicles. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine, 88 (8): 681–692 
[91] Schmitt A., van Griensven M., Imhoff A. B., Buchmann S. 2012. Application of Stem Cells in Orthopedics. Stem Cells International, Article ID 394962, 1–11. 
[92] Shanthly N., Aruva M. R., Zhang K., Mathew B., Thakur K. L. 2006. Stem Cells: a Regenerative Pharmaceutical. Nuclear Medicine and Molecular Imaging, 50 (3): 205–216
[93] Shin’oka T., Imai Y., Ikada Y. 2001. Transplantation of a Tissue-Engineered Pulmonary Artery. The New England Journal of Medicine, 344 (7): 532–533
[94] Steward MM1, Sridhar A, Meyer JS. Neural regeneration.Curr Top Microbiol Immunol. 2013;367:163-91. 
[95] Takahashi K. Tanabe K. Ohnuki M. Narita M. Ichisaka T. Tomoda K. Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 2007;131:861–872.
[96] Tamulaitienė M., Romanovskaja Z., Juocevičius A., Janonienė D. 2012. Sergančiųjų reumatoidiniu artritu funkcinių gebėjimų sąsajos su judamumu, savipriežiūra ir namų veiklomis. Gerontologija, 13 (1): 46–53
[97] Tyndall A., van Laar J. M. 2010. Stem Cells in the Treatment of Inflammatory Arthritis. Best Practice & Research Clinical Rheumatology, 24 (4): 565–574
[98] Tuder R. M., Janciauskiene S., Petrache I. 2010. Lung Disease Associated with α-1 Antitrypsin Deficiency, Proceedings of the American Thoracic Society, 7: 381–386
[99] Van Buul G. M., Villafuertes E., Bos P. K., Waarsing J. H., Kops N., Narcisi R., Weinans H., Verhaar J. A. N., Bernsen M. R., van Osch J. J. V. M. 2012. Mesenchymal Stem Cells Secrete Factors that Inhibit Inflammatory Processes in Short-Term Osteoarthritic Synovium and Cartilage Explant Culture. Osteoarthritis and Cartilage, 20 (10): 1186–1196
[100] Wakitani S., Okabe T., Horibe S., Mitsuoka T., Saito M., Koyama T., Nawata M., Tensho K., Kato H., Uematsu K., Kuroda R., Kurosaka M., Yoshiya S., Hattori K., Ohgushi H. 2011. Safety of Autologous Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cell Transplantation for Cartilage Repair in 41 Patients with 45 Joints Followed for up to 11 Years and 5 Months. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, 5 (2): 146–150
[101] Wang H. M., Chou Y. T., Wen Z. H., Wangs Z. R., Chen C. H., Ho M. L. 2013. Novel Biodegradable Porous Scaffold Applied to Skin Regeneration. PLoS ONE 8 (6): e56330
[102] Wefer J., Sievert K. D., Schlote N., Nunes L., Dahiya R., Gleason C. A., Tanagho E. A. 2001. Time Dependent Smooth Muscle Regeneration and Maturation in a Bladder Acellular Matrix Graft: Histological Studies and in vivo Functional Evaluation. The Journal of Urology, 165 (5): 1755–1759
[103] Weng JY1, Du X, Geng SX, Peng YW, Wang Z, Lu ZS, Wu SJ, Luo CW, Guo R, Ling W, Deng CX, Liao PJ, Xiang AP.Mesenchymal stem cell as salvage treatment for refractory chronic GVHD. Bone Marrow Transplant. 2010;45(12):1732-40.
[104] Zhang Y. 2008. Bladder Reconstruction by Tissue Engineering – With or Without Cells? The Journal of Urology, 180: 10–11
[105] Zhang M., Mal N., Kiedrowski M., Chacko M., Askari A. T., Popovic Z. B., Koc O. N., Penn M. S. 2007. SDF-1 Expression by Mesenchymal Stem Cells Results in Trophic Support of Cardiac Myocytes after Myocardial Infarction. Faseb Journal, 21 (12): 3197–3207
[106] Zhao T, Zhang ZN, Rong Z, Xu Y. Immunogenicity of induced pluripotent stem cells. Nature 2011; 474: 212–5.Takahashi K. Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 2006; 126:663–676.

Lecturer