Rekombinantinių mokelulių kūrimas ir tyrimai

Free Register

Rekombinantinių baltymų produkavimo principai

Terapiniai baltymai iš pradžių buvo išskirti iš žmogaus audinių arba kraujo, pavyzdžiui, kraujo krešėjimo faktoriai ir žmogaus serumo albuminas iš plazmos, insulinas iš kasos ir gliukocerebrozidazė iš placentos. Tačiau baltymų išskyrimas iš audinių (gyvūno arba žmogaus) turi tam tikrų trūkumų, kadangi išskiriami nepakankami biologinės medžiagos kiekiai, kurių neužtenka pramoninei produkcijai. Be to, tokios medžiagos gali būti užterštos patogenais (virusais ir/arba prionais). Net jei būtų galima gauti pakankamus baltymo kiekius iš žmogaus audinių, gali būti daug saugiau naudoti genetinės inžinerijos būdu gautus produktus. Greta saugumo, pagrindinis rekombinantinių baltymų privalumas yra tas, kad jie tarnauja kaip platforma, vystant pažangesnius produktus, pasižyminčius didesniu saugumu, mažesniu imunogeniškumu, didesniu pusamžiu ir geresniu bioprieinamumu.

Produkuojant rekombinantinius baltymus pagrindinis klausimas yra – kokia baltymo ekspresijos sistema bus pasirinkta – t.y. kur baltymas bus ekspresuojamas. Yra trys pagrindinės sistemos, skirtos rekombinantinių baltymų ekspresavimui: Escherichia coli, mielės ir bakulovirusai. Be šių pagrindinių sistemų, tai pat gali būti taikomos ir kitokios sistemos, įskaitant kitas bakterijas (pvz. Lactococcus lactis), augalų ląsteles arba žinduolių ląsteles. 

Pati metodologija visoms ekspresijos sistemoms fundamentiškai nesiskiria. Pagrindiniai reikalavimai yra: turėti heterologinį baltymą koduojančią seką, vektorių (dažniausiai plazmidę), į kurį bus įterpiama koduojanti seka ir šeimininką, kuriame bus ekspresuojamas heterologinis baltymas. Nepriklausomai nuo to, koks bus geno ekspresijos šeimininkas (ar kokia bus pati seka), sekos įterpimas į plazmidę ir jos padauginimas atliekami E. coli organizme.

Įterpiant koduojančią seką į plazmidę yra svarbu kartu įterpti ir antro peptido ar baltymo seką, kad abu baltymai būtų ekspresuojami kaip vienas vienetas. Šios papildomos sekos vadinamos afiniškumo žymenimis ir yra labai reikalingos tolimesniam rekombinantinio baltymo išgryninimui iš šeimininko ląstelės, nepriklausomai nuo biocheminių paties baltymo savybių. Šie afiniškumo žymenys prisijungia prie specifinio ligando, kuris paprastai būna imobilizuotas, ir tokiu būdu žymenį turintis baltymas nesunkiai atskiriamas nuo kitų (šeimininko) baltymų, kurie prie ligando neprisijungia. Paprastas tokio afiniškumo žymens pavyzdys – šešių histidino liekanų grupė, koordinuojanti dvivalenčius katijonus. Šiuo atveju histidino liekanomis pažymėto baltymo išgryninimui naudojama imobilizuota metalų afininė chromatografija (IMAC). Yra naudojama daug įvairių afiniškumo žymenų – pradedant minėtu nedideliu histidino liekanų žymeniu, baigiant daug didesniais žymenimis, kaip kad gliutationo S-transferazė (GST, apie 26 kDa). Tokie žymenys gali turėti ženklų poveikį žymimojo baltymo tirpumui, tačiau, bendru atveju, rekombinantinis baltymas yra gana švariai išgryninamas panaudojant afininę chromatografiją. Jei reikalingas didesnis švarumas, naudojami kitokie baltymo išgryninimo metodai. Pavyzdžiui, efektyvioji skysčių chomatografija (HPLC) ar kt. 

Visose įprastai naudojamose ekspresijos sistemose taikomi ekspresijos vektoriai, koduojantys žymenis, todėl koduojamoji seka yra ekspresuojama kartu su minėtuoju žymeniu. Paprastai vektoriaus sekoje yra iniciacijos kodonas, tuomet seka žymens seka ir heterologinį baltymą koduojanti seka. Dažnai taip pat yra įterpiama proteazių skėlimo sritis, įgalinanti atskirti vektoriaus koduojamas sekas (t.y. žymenį) nuo gryninamo baltymo. Gryninimo procedūros, taikomos iš kultivuojamų ląstelių padarytam lizatui, iš esmės yra vienodos, nepriklausomai nuo ekspresijos sistemos (Pav. 1).  

 1

Pav. 1. Rekombinantinių baltymų ekspresijai naudojamo konstrukto schema ir ekspresuojamo baltymo gryninimas. Panašūs konstruktai naudojami nepriklausomai nuo ekspresijos sistemos. Linijos atspindi nekoduojančias sekas, stačiakampiai – koduojančias. RBS – ribos

E. coli ekspresijos sistemos.

Produkuojant rekombinantinius baltymus daugelio tyrėjų pirmasis pasirinkimas yra E. coli organizmas. E. coli ekspresijos sistema, lyginant su kitomis, pasižymi nemažai privalumų: nesudėtingos auginimo sąlygos, greitas biomasės sukaupimas ir paprastas masto padidinimo procesas. Šis prokariotinis organizmas dažnai naudojamas terapiniams ar komerciniams tikslams skirtų baltymų industrinei produkcijai. Ši sistema pasirenkama, kuomet norima gauti santykinai nedidelius, tirpius ir nemodifikuotus baltymus. Būtent šią sistemą naudodamos farmacinės kompanijos pagamina daugiau nei pusę savo produkuojamų rekombinantinių baltymų.

Ekspresijos mastas gali varijuoti nuo keleto mililitrų pilotiniams tyrimams iki tūkstančių litrų industrinės fermentacijos procesui. Paprastai, klonavus įterptą vektorių, yra atliekami pilotiniai (nedidelio masto gryninimo) klonų raiškos patikrinimo tyrimai. Baltymus ekspresuojantys klonai gali būti nustatyti SDS-PAGE ir Western blotting metodais, panaudojus antiserumą prieš patį rekombinantinį baltymą arba prieš žymenį (paprastai monokloninį antikūną, atpažįstantį histidino liekanų ar kitokį žymenį). Ekspresuojamas klonas yra nustatomas ir naudojamas 50-250 ml kiekiais tolimesniam ekspresijos sąlygų optimizavimui ir gerinimui bei išgryninimo optimizavimui.

Didelio masto ekspresijai iš dviejų litrų bakterijų kultūros (Luria Bertani mitybinė terpė + kanamicinas + ampicilinas) gaunama maždaug 50-80 g grynojo svorio ląstelių. Jei baltymas agreguoja į inkliuzinius kūnelius, tuomet yra gaunama maždaug 100-300 mg rekombinantinio baltymo (2-5 % visų baltymų). Jeigu baltymas yra tirpus (ko dažniausiai ir yra norima), tuomet kiekiai bus šiek tiek mažesni. Didesnius baltymo ekspresijos kiekius galima gauti panaudojus praturtintą terpę (pvz., terrific), kurioje ląsteles galima auginti didesniais kiekiais. 

Vis dėlto, bakterijų ekspresijos sistema turi tam tikrų trūkumų. Paskaičiuota, kad tik 50 % bakterinių baltymų ir tik 10 % eukariotinių baltymų galima ekspresuoti E. coli organizme tirpioje formoje. Taigi, daugeliu atveju E. coli gali būti netinkama sistema. Be to, tirpių baltymų ekspresijos kiekis mažėja, kuomet baltymo molekulinė masė yra daugiau nei 60 kDa. Rekombinantinių baltymų koekspresija kartu su molekuliniais šaperonais arba karščio šoko baltymais gali pagerinti baltymų tirpumą bei išsaugoti natyvią (t. y. kaip kad nerekombinantinių baltymų) konformaciją.

Ekspresuojant baltymus E. coli citoplazmoje susiduriama su dar viena problema – redukuojančioje bakterijos citoplazmos aplinkoje nesusiformuoja disulfidiniai ryšiai. Tai sąlygoja blogą tokių baltymų susipakavimą. Sumažinti šį procesą galima nukreipiant baltymus į periplazmą, tačiau dažnai daug paprasčiau tokiu atveju naudoti eukariotinį šeimininką. 

Dar vienas svarbus trūkumas – E. coli organizmo negebėjimas glikozilinti baltymus. Nors tai nesudaro problemų daugelio veterinarijos tikslams reikalingų baltymų atžvilgiu, didelė dalis terapiniams tikslams taikomų baltymų yra glikozilinami. Atradus su N-galu susijusį glikozilinimą kai kuriose bakterijų rūšyse, daug pastangų buvo dėta siekiant sukurti E. coli kamienus, galinčius prikabinti glikanus prie baltymų. Be to, naudojant tokius baltymus vakcinacijos ar terapiniams tikslams, reikia patikrinti bioaktyvumą (jei įmanoma) bei LPS likučių kiekį preparatuose.

Jeigu vis dėlto reikalinga eukariotinė ekspresijos sistema, tuomet esama keleto alternatyvų. Pati paprasčiausia iš tokių yra mielės. Šiam tikslui dažniausiai naudojami du mielių tipai – Saccharomyces cerevisiae ir metilotrofinės mielės Pichia pastoris.  

Baltymų ekspresija mielėse

Mielių ekspresijos sistema jau keletas dešimtmečių sėkmingai naudojama įvairios kilmės heterologinių baltymų produkcijai, tiek žmogaus baltymų terapiniams tikslams, tiek patogeninių baltymų vakcinavimo tikslams. Mielės yra svarbus šeimininkas, naudojamas tyrimų tikslais, kuomet norima produkuoti aktyvų baltymą, kuris negali būti ekspresuojamas E. coli organizme. Panašiai kaip ir prokariotinis E. coli organizmas, mielės pasižymi tokiais pranašumais, kaip kad nesudėtingas mikrobinis augimas ir kultivavimas nebrangioje auginimo terpėje. Taip pat, naudojant mieles atsiranda galimybė įvairioms posttransliacinėms modifikacijoms, pvz., O- ar N-galo glikozilinimas, fosforilinimas, disulfidinių tiltelių formavimasis, proteolitinis apdorojimas ir susilankstymas eukariotinėje sistemoje. Vis dėlto, yra keletas sudėtingų posttransliacinių modifikacijų, kurių mielėse atlikti negalima. Tai – prolilo hidroksilinimas ir amidinimas.

Saccharomyces cerevisiae istoriškai jau seniai naudojamos maisto ir gėrimų industrijose, o genų ekspresijos tyrimuose jos naudojamos kaip darbinis arkliukas jau keletą dešimtmečių. Ekspresija gali būti vykdoma nuo tokių stiprių konstitutyvių promotorių, kaip kad alkoholio dehidrogenazės (ADHI) ar enolazės (ENO), arba indukuojamų promotorių (PHO, CUP1, GAL1 ir G10). Šių mielių pagrindinis privalumas yra palengvinti svetimo baltymo nukreipimą į sekrecinį kelią. Tai įgyvendinama suliejant brandžios formos norimą rekombinantinį baltymą su mielių poravimosi faktoriaus signaline seka. Baltymo susilankstymas, disulfidinių tiltelių formavimasis ir glikozilinimas vyksta sekrecijos metu. Ši sistema ypatingai naudojama parazitų proteazių sekrecijai.

Viena nepageidaujama S. cerevisiae savybė yra polinkis hiperglikozilinti baltymus. Tai gali pabloginti dominančio baltymo antigenines savybes ar funkcijas, nes užmaskuojami svarbiausi epitopai ar funkcinės sritys. Kita vertus, galinės α, 1, 3 glikono jungtys dėl savo hiperantigeninės prigimties padaro baltymus netinkamus terapiniams tikslams. Siekiant produkuoti baltymą, tinkantį vakcinavimo tikslams, atliekamos koduojančios DNR modifikacijos, tokiu būdu tos amino rūgštys, kurios yra glikozilinimo taikiniai, yra pakeičiamos. Tačiau, jeigu natūraliai baltymas turi būti glikozilinamas, tokie pakeitimai gali panaikinti imunogeniškumą ir/ar aktyvumą. Tokiu atveju, reikia ieškoti alternatyvių ekspresijos sistemų.

Galiausiai, S. cerevisiae paprastai ekspresuoja santykinai nedidelius rekombinantinio baltymo kiekius, tačiau naudojant kitas mielių rūšis galima gauti daug didesnius kiekius. Pichia pastoris išlaiko visus S. cerevisiae būdingus ekspresijos privalumus, tačiau naudojant šią rūšį galima produkuoti daug didesnius baltymo kiekius. P. pastoris yra metanotrofinės mielės, galinčios vykdyti ekspresiją nuo alkoholio oksidazės I (AOX I) promotoriaus. Tai vienas iš pačių stipriausių reguliacinių promotorių, kurie yra žinomi. P. pastoris genome galima specifinėse srityse sulieti ekspresuojančias plazmides kaip pavienes arba kaip daugybines kopijas. Be to, šias mieles galima nesunkiai auginti fermentatoriuose labai dideliais tankiais, taip užtikrinant rekombinantinio baltymo produkcijos didelius kiekius.

AOX I promotorių stipriai represuoja gliukozės buvimas, o jo indukcijai reikalingas metanolis kaip anglies šaltinis. Nors tai maksimaliai indukuoja rekombinantinio baltymo ekspresiją, metanolio naudojimas yra laikomas pavojingu (kaip naftos produktas) ir todėl nėra rekomenduojama terapiniams tikslams skirtų baltymų produkcijai. Konstitutyvus gliceraldehido 3 fosfato dehidrogenazės (GAP) promotorius gali vykdyti ekspresiją esant gliukozės ir glicerolio substratams, o nuo glutationo priklausoma formaldehido dehidrogenazė (FLDI) yra dar vienas promotorius, kuris gali būti indukuojamas metilaminu (netoksinis azoto šaltinis).

Panašiai kaip ir S. cerevisiae atveju, taip ir P. pastoris atveju, vienas iš pagrindinių trūkumų yra hiperglikozilinimo grėsmė. Neseniai buvo sukurti kamienai, galintys iš dalies apeiti šiuos apribojimus. Vis dėlto, nebloga alternatyva yra ekspresijai naudoti vabzdžių ląsteles.

Baltymų produkcija vabzdžių ląstelėse, panaudojant bakulovirusus

Baltymų produkcija komerciniams tikslams vabzdžių ląstelėse yra labai plačiai naudojama. Sistema yra paremta rekombinantinio bakuloviruso gebėjimu infekuoti vabzdžių ląsteles, kuomet bakuloviruso koduojamas baltymas yra ekspresuojamas infekuotos ląstelės viduje. Ši ekspresijos sistema buvo sukurta 1983 metais žmogaus interferono β produkcijai. Bakulovirusus naudojant vykdoma baltymų ekspresija pasižymi daugybe privalumų: stipraus polihedrino promotoriaus vykdoma aukšto lygio ekspresija, įvairių posttransliacinių modifikacijų galimybė vabzdžių ląstelėse, didelė talpa daugybiniams genams ar dideliems insertams bei biosaugumas ir nesudėtingas naudojimas. Ypač dideli produkuojamo baltymo kiekiai reiškia, kad bakulovirusų ekspresijos sistema idealiai tinka industrinei baltymų produkcijai. Didelis kiekis vabzdžių ląstelėse produkuotų baltymų buvo patikrinti kaip galimi kandidatai profilaktinėms vakcinoms prieš įvairius infekcinius veiksnius, kaip ŽIV, hepatito C virusą, enterovirusą, SARS-CoV virusą, dengė karštligės virusą, rota virusą, žmogaus ir paukščių gripo virusą ir įvairius pirmuonių parazitus. Nemažai komerciškai prieinamų vakcinų yra  produkuojamos šiose ekspresijos sistemoje: Bajovac CSF E2Tm (klasikinis kiaulių maras, Bayer AG), Ingelvac (2 tipo kiaulių virusas, Boehringer Ingelheim) ir FluBioKTm (HA vakcina, Protein Science Corp).

Bakulovirusų genome yra genas, koduojantis gausiai esantį baltymą polihedriną. Šis baltymas susikaupia infekuotose vabzdžių ląstelėse (Spodoptera frugiperda Sf9, Trichoplusiana ir Drosophila bei Bombyx mori ląstelių linijose) infekcinio ciklo pabaigoje ir tuomet yra išskiriamas į auginimo terpę. Polihedrino baltymas nėra esminis viruso reprodukcijai, todėl jį koduojantis genas gali būti pakeistas heterologine koduojančia seka, kuri tuomet tampa ekspresuojama dideliais kiekiais. Ši sistema tinka suspensinėms kultūroms, todėl ją taikant galima santykinai lengvai sugeneruoti didelius kiekius baltymo.

Siekiant produkuoti baltymą, heterologinė koduojanti seka yra įterpiama į perkėlimo vektorių, kuris šią seką įterpia į polihedrino geną viruso genome. Po perkėlimo vektoriaus ir viruso genomo kotransfekcijos į vabzdžių ląsteles, heterologinė seka įsiterpia į atitinkamą vietą už stipraus polihedrino promotoriaus. Lyginant su bakterijų ir mielių ekspresijos sistemomis, santykinai daug laiko užtrunka sukurti baltymų ekspresijai reikalingus klonus. Daug komercinių sistemų yra kuriamų taip, kad rekombinantinių virusų produkcija būtų kuo efektyvesnė, kadangi šis etapas ir yra sistemos efektyvumą ribojantis veiksnys.

Vis dėlto, vienas iš pagrindinių bakulovirusų ekspresijos sistemos privalumų yra tas, kad vabzdžių ląstelėse ekspresuojami baltymai yra labiau panašus į žinduoliams būdingus baltymus, negu naudojant bakterijų ar mielių ekspresijos sistemas. Ypač tai svarbu tais atvejais, kuomet yra reikalingas glikozilinimas, kadangi vabzdžių ląstelėse N-galo glikozilinimas vyksta panašiai kaip žinduolių ląstelėse, nors ir prikabinti glikanai dažnai nėra tokie sudėtingi. Kaip bebūtų, ši sistema apeina hiperglikozilinimo problemą, kuri būdinga mielių ekspresijos sistemoms. Tačiau yra dedama daug pastangų modifikuojant bakulovirusų ekspresijos sistemą taip, kad jos produkuojami glikoproteinai būtų prikabinti su žinduolių ląstelėms būdingais glikanais.

Vis dėlto, jeigu žinduolių baltymams reikalingos posttransliacinės modifikacijos ir jie turi pasižymėti šeimininkui būdingomis savybėmis, tuomet kaip ekspresijos sistema gali būti reikalinga žinduolių audinių kultūra.

Baltymų produkcija žinduolių ląstelėse

1986 metais žmogaus audinių plazminogeno aktyvatorius tapo pirmuoju žinduolių ląstelėse produkuotu baltymu, skirtu terapiniams tikslams, kuriam buvo suteiktas prekybos leidimas. Šiuo metu apie 60-70 % visų rekombinantinių baltymų, naudojamų farmaciniams tikslams yra produkuojama žinduolių ląstelėse. Kaip ir žmogaus audinių plazminogeno aktyvatorius, daugelis šių baltymų yra ekspresuojami imortalizuotose kiniško žiurkėno kiaušidžių (CHO) ląstelėse. Tačiau taip pat naudojamos ir kitos ląstelių linijos: išskirtos iš pelių mielomos (NS0), žiurkėno naujagimio inkstų (BHK), žmogaus embriono inkstų (HEK-293), žmogaus tinklainės ląstelių ir kt. Nors didžioji dalis šiuo metu biofarmacinei produkcijai naudojamų žinduolių ląstelių yra auginamos suspensinėje kultūroje, patys gamybiniai metodai gerokai skiriasi.

2

Pav. 2. Rekombinantinių baltymų gamybinis procesas. Banguotos linijos rodo atskirų ląstelių linijų subkultivavimą siekiant jas patikrinti ir gauti galutinį produktą. Mėgintuvėliai rodo skystame azote šaldomas ląsteles. Flakonai su maišytuvais žymi masto sumaži sumažinimo sistemas, naudojamas optimizavimo procesui, o bioreaktoriai atspindi plataus masto produkcijos procesus. Pagal Wurm, 2004.

Rekombinantinių baltymų produkcija žinduolių ląstelėse paprastai vykdoma pagal vieną bendrą schemą (Pav. 2). Iš pradžių rekombinantinis genas su reikalingais reguliaciniais elementais yra perkeliamas į ląsteles. Taip pat į ląstelę yra įterpiamas antrasis genas, kuris suteikia ląstelei recipientei tam tikrą pranašumą. Praėjus keletui dienų po genų perkėlimo yra įvedamas tam tikras selekcijos veiksnys ir tuomet išgyvena tik tos ląstelės, kurios ekspresuoja įvestą selekcinį geną. Selekcijai dažniausiai naudojami genai yra: dihidrofolato reduktazė (DHFR) – nukleotidų metabolizme dalyvaujantis fermentas, ir glutamino sintetazė (GS). Abiem atvejais, selekcija įvyksta aplinkoje neesant atitinkamo metabolito (DHFR atveju – hipoksantino ir timidino, GS atveju – glutamino). Tokiu būdu, netransformuotos ląstelės žūva. Bendru atveju, efektyviai rekombinantinio baltymo ekspresijai nėra svarbu, ar biofarmacinę medžiagą koduojantis genas ir selekcinis genas yra toje pačioje plazmidėje ar ne.

Atlikus selekciją, išgyvenusios ląstelės yra perkeliamos į kitą kultivavimo indą, kuriame auga sudarydamos klonų populiacijas. Galiausiai, individualūs klonai yra įvertinami pagal rekombinantinio baltymo ekspresiją ir geriausi produktoriai paliekami tolimesniam kultivavimui ir analizei. Iš šių kandidatų galiausiai pasirenkama viena ląstelių linija, pasižyminti atitinkamomis augimo ir produktyvumo charakteristikomis. Ši ląstelių linija ir produkuoja rekombinantinį baltymą. Pats kultivavimo procesas tuomet būna parenkamas pagal poreikius. Kol kas visi terapiniams tikslams skirti žinduolių rekombinantiniai baltymai natūraliai yra sekretuojami baltymai arba yra gauti iš genų konstruktų, kurie veikia kaip baltymų sekrecijos tarpininkai.

Nors pati koncepcija išliko nepasikeitusi nuo 1980-ųjų vidurio, rekombinantinių ląstelių linijų produktyvumas per pastaruosius dešimtmečius žymiai išaugo. Dideli šių dienų produkto kiekiai yra ilgus metus trukusių tyrimų rezultatas. Šie tyrimai padėjo geriau suprasti genų ekspresijos, metabolizmo, augimo ir apoptozės vėlinimo mechanizmus žinduolių ląstelėse. Apskritai, buvo atlikti vektorių patobulinimai, šeimininko ląstelių inžineriniai pokyčiai, pagerintos terpės ir tikrinimo metodai bei paties proceso projektavimas ir vystymas. 

Rekombinantinių ląstelių linijų sukūrimui paprastai naudojami stiprius promotorius/enhanserius turintys virusiniai ar ląsteliniai ekspresijos vektoriai, vykdantys rekombinantinio geno ekspresiją. Daugeliu atvejų, dominantis genas yra izoliuojamas kaip kDNR be intronų. Yra žinoma, kad efektyvus iRNR citoplazminis transportavimas ir transliacija eukariotinėse ląstelėse priklauso nuo splaisingo. Didžioji ekspresijos vektorių dalis šiuo metu turi bent vieną introno seką, esančią dažniausiai tarp promotoriaus ir kDNR koduojančios sekos. Modifikuojant pačią koduojančią sritį taip pat galima pagerinti geno raiškos lygį. Pavyzdžiui, žinduolių genas su retais tRNR kodonais nebus ekspresuojamas aukštu lygiu, tačiau pakeitus tRNR kodonus į plačiau esančius kodonus galima geną paversti stipriai ekspresuojamu.

1973 metais Graham ir van der Eb parodė, kad perkelti DNR į kultivuojamas žinduolių ląsteles galima paveikus ląsteles DNR nanodalelėmis ir kalcio fosfatu. Nevirusinis genų perkėlimo būdas išlieka pageidautinu metodu generuojant stabilias ląstelių linijas gamybiniais tikslais. Iš tokių metodų rutiniškai naudojami yra: kalcio fosfato transfekcija, elektroporacija, lipofekcija ir biolistinis ar polimerų pagalba vykdomas genų perkėlimas. Visi šie metodai yra efektyvūs ir patikimi, tačiau nėra įmanoma įvertinti, kuris iš minėtų metodų yra geresnis, kadangi trūksta išsamių tyrimų. 

Rekombinantinis genas ir selekcinis genas gali būti tame pačiame vektoriuje arba skirtinguose vektoriuose. Kuomet jie yra tame pačiame vektoriuje, jie gali būti ekspresuojami nuo policistroninių iRNR. Siekiant padidinti aukšto lygio produkuojančių ląstelių linijų gavybą, selekcinių genų raiška gali būti vykdoma nuo silpnų promotorių. Nors šis metodas dažniausiai sumažina transfekcijos efektyvumą, po selekcijos išlikusios tokios ląstelės produkuoja daugiau rekombinantinio baltymo.

Plazmidžių linearizavimas prieš transfekciją pagerina transfekcijos efektyvumą, tačiau superspiralinės plazmidžių DNR molekulės dėl endo- ir egzonukleazių aktyvumo branduolyje taip pat yra verčiamos į linijines molekules praėjus 1-2 valandoms po transfekcijos. Branduolio ligazės užtikrina atskirų plazmidės DNR molekulių kovalentinį jungimąsi, o rekombinantiniai fermentai katalizuoja šių junginių bei pavienių plazmidės molekulių integraciją į šeimininko genomą. Procesas vyksta nehomologinės rekombinacijos būdu. Plazmidinės DNR ligavimas prieš integraciją yra priežastis, dėl ko dažnai vienoje vietoje kointegruojasi daugybinės plazmidės molekulės. Didžiojoje dalyje gamybinių procesų yra naudojamos ląstelių linijos su į šeimininko chromosomas integruotais transgenais.

Integracijos vieta turi pagrindinį poveikį rekombinantinio geno transkripcijos greičiui (šis reiškinys žinomas kaip pozicinis efektas). Jeigu transgenas integruojasi į neaktyvų heterochromatiną, jis ekspresuojamas labai nežymiai arba visai neekspresuojamas. Tuo tarpu, integracija į aktyvų euchromatiną paprastai įgalina transgeno ekspresiją. Vis dėlto, jeigu norima užtikrinti ilgalaikę rekombinantinio geno raišką, gali nepakakti vien integracijos į euchromatiną. Transgeno raiška žinduolių ląstelėse yra daugeliu atvejų greitai inaktyvuojama (nutildoma) galimai dėl greta esančio kondensuoto heterochromatinio įtakos. Genų nutildymas koreliuoja su histonų hipoacetilinimu, histono H3 9 lizino metilinimu ir padidėjusiu CpG metilinimu transgeno promotorinėje srityje. 

Yra sukurta keletas strategijų, siekiant apeiti  šį atsitiktinės integracijos sukeltą neigiamą pozicinį efektą. Apsauginius cis-reguliatorinius elementus sudaro izoliatoriniai elementai, prisijungiantys elementai, karkaso/matrikso prisijungimo sritys, visur esantys chromatino atvėrimo elementai ir konservatyvūs antirepresoriniai elementai. Su šiais elementais besijungiantys transgenai sumažina heterochromatino poveikį ir įgalina stabilią transgeno ekspresiją. Kitas būdas inhibuoti slopinimo procesą yra užblokuojant histonų deacetilinimą panaudojant butiratus. Dar vienas būdas, taikomas siekiant išvengti pozicinių efektų, yra nukreipti transgeno integraciją į transkripciškai aktyvias genomo sritis.

Kaip bebūtų, homologinė rekombinacija tarp transfekuotos plazmidės DNR ir genomo įvyksta retai. Vienas būdas padidinti kryptingo integravimosi tikimybę yra panaudojant tokius fermentus, kaip bakteriofago P1 Cre rekombinazę, lambda fago integrazę ar mielių Flp rekombinazę. Tokių fermentų panaudojimas įgalina DNR apsikeitimą tarp genomo ir transfekuotos plazmidės. Šie fermentai apsikeitimą katalizuoja aukštais dažniais, jeigu donorinė ir recipientinė DNR yra ribojamos specifinių prisijungimo sričių. Vykdant kryptingą genų integraciją yra kritiška nustatyti itin aktyvias transkripcijos sritis. Jeigu aktyvi sritis nėra nustatyta, receptorinė sritis rekombinacijai įterpiama atsitiktinai ir vėliau šimtai klonų yra tikrinami, iš kurių atrenkami tie, kuriuose integracija įvyko taip vadinamose gerose srityse. 

Puikios kokybės ląstelių auginimui skirta komercinė terpė šiuo metu yra prieinama iš keleto pagrindinių tiekėjų. Vis dėlto, pirmaujantys rekombinantinių baltymų gamintojai, matyt, investuoja daug darbo optimizuojant savo pačių terpių sudėtis. Paprastai, keleto skirtingų sudėčių terpės yra reikalingos vienam gamybiniam procesui, o kiekviena tokia terpė yra reikalinga tam tikrai fazei. Terpės, kuri reikalinga greitam augimui subkultivuojant ląsteles kas 3-5 dienas, sudėtis skiriasi nuo tos terpės, kuri naudojama pačiam produkavimui. Vienos partijos (6-8 dienos) ar išplėstos partijos (10-21 dienos) produkcijos procesas yra daug ilgesnis negu įprastinis subkultivavimo laikotarpis. Taigi, terpės optimizavimas yra itin svarbus procesas, kuris turi būti atliekamas atsižvelgiant į individualius kiekvienam procesui as ląstelių linijai svarbius poreikius.

Seniau, fetalinio veršio serumo įdėjimas koncentracijomis 1-20% į auginimo terpę buvo būtinas žinduolių ląstelių auginimui. Šiuo metu, didžioji plataus masto ląstelių kultūrų auginimo dalis yra vykdoma terpėse be serumo. Šiuolaikinės terpės puikiai palaiko ląstelių augimą neturėdamos savo sudėtyje serumo kilmės peptidų, augimo faktorių bei iki galo nenustatyto baltymų, lipidų, angliavandenių ir mažų molekulių rinkinio. Pagrindinės priežastys, kodėl serumas nebėra naudojamas, yra jo neapibrėžta sudėtis, pavojus perduoti papildomus veiksnius (pvz., jaučio virusus ir prionus) bei jo kaina.

Laikui bėgant, patobulinta buvo ne tik terpė, bet ir šeimininko ląstelės. Manoma, kad itin dideli produkuotojai yra ląstelių linijos, kurios genetiškai paveiktos, kad būtų labiau atsparios gyvybingumą mažinantiems poveikiams ir/arba turinčios augimą skatinančius transgenus. Yra atlikta daugybė tyrimų, rodančių, kaip rekombinantinių šeimininko ląstelių linijų augimas, išgyvenamumas ir produktyvumas gali būti pagerinti atliekant genetinę inžineriją. Siekiant sugeneruoti itin stiprius produktorius, į ląstelių linijas buvo įterpti protoonkogenai, ląstelės ciklo kontroliniai genai (ciklinai), augimo faktorių genai (pvz., į insuliną panašūs augimo faktoriai) bei antiapoptotiniai genai. 

Kitas svarbus patobulinimas yra posttransliacinių baltymų modifikacijų ir apdorojimo gerinimas. Pavyzdžiui, buvo parodyta, kad antikūnų efektyvumas gali būti pagerintas sustiprinant jų natūralių imuninių poveikių funkcijų galią. Stabili padidinta N-acetilglukozaminiltransferazės-III (fermentas, kuris natūraliomis sąlygomis CHO ir NS0 ląstelėse neekspresuojamas) ekspresija rekombinantinėse antikūnus produkuojančiose ląstelėse generuoja IgG, pasižyminčius dideliais kiekiais pusiau padalytų, nefukozilintų oligosacharidų Fc srityje. Tokios glikoformos modifikacijos sukelia 5-10 kartų didesnį nuo antikūnų priklausomą ląstelių citotoksiškumą. 

Siekiant selekcionuoti transfekuotas ląsteles, egzistuoja įvairios sistemos, tarp jų ir atsparumo antibiotikams (pvz., neomicinui, higromicinui ir puromicinui). Vis dėlto, labiausiai paplitęs metodas yra selekcionuoti CHO ląsteles, neturinčias DHFR aktyvumo, kuriose transfekuotas DHFR genas. Renkantis selekcinį veiksnį svarbus yra selektyvumo laipsnis arba svarumas. Svaresnis veiksnys atrinks tik tas ląsteles, kurios ekspresuos selekcinį geną ir, daugeliu atvejų, rekombinantinį geną, didesniais kiekiais. Didesnis svarumo lygis gali sumažinti kandidatinių ląstelių linijų tikrinimui skirtą darbą. 

Taikant DHFR sistemą, rekombinantinio baltymo raiškos padidinimas gali būti pasiektas veikiant ląsteles metotreksatu (MTX), kuris blokuoja DHFR aktyvumą. Praėjus 2-3 savaitėms po MTX poveikio didžioji ląstelių dalis žūva, tačiau nedidelis kiekis ląstelių, perprodukuojančių DHFR, gali atlaikyti beveik bet kokio MTX kiekio poveikį. Esant vis didesnių koncentracijų MTX poveikiui, išgyvenančios ląstelės dažnai turi nuo kelių šimtų iki kelių tūkstančių įsiterpusios plazmidės kopijų, kurios paprastai būna pailgėjusiose chromosomose. Dažniausiai tokios sustiprintos ląstelės produkuoja daugiau rekombinantinio baltymo negu nesustiprintos ląstelės, tačiau specifinio produktyvumo padidėjimas (iki 10 ar 20 kartų) kinta tarp individualių klonų.

Nors genų amplifikacija ne visada reikalinga, kadangi pirminiuose ląstelių klonuose ekspresijos lygis būna pakankamai aukštas, ją atlikti galima ir GS transfekuotose NS0 ląstelėse. GS katalizuoja glutamino produkciją iš glutamato ir amoniako, o pastarasis junginys yra nepageidaujamas ląstelių šalutinis produktas. Taigi, GS sistema pasižymi dvigubu privalumu: sumažinamas amoniako kiekis ląstelių kultūros terpėje ir ląstelėms yra teikiama nestabili amino rūgštis (glutaminas). Panaudojant metionino sulfoksiminą (MSX) galima specifiškai ir negrįžtamai inhibuoti GS. Esant 10-100 μM MSX koncentracijoms galima identifikuoti ir atrinkti atsparius NS0 ląstelių populiacijos klonus, kuriuose buvo amplifikuotas GS geną turintis transgenų kompleksas, o taip pat ir dominantis genas/genai.

Skirtingų ląstelių klonų, įskaitant tuos, kurie gauti amplifikavus genus, baltymo ekspresijos lygiai yra labai skirtingi ir gali viršyti dviejų laipsnių dydį. Dėl to stipriai produkuojančių ląstelių linijų identifikavimas tampa varginančia ir daug darbo reikalaujančia veikla, kurios metu reikia patikrinti šimtus ląstelių linijų. Egzistuoja keletas metodikų, skirtų klonų atskyrimui. Pati populiariausia klonavimo metodika yra naudoti ribinį praskiedimą ir daugiašulinėlinius pleitus. Taip pat, gali būti naudojami stikliniai ar metaliniai klonavimo žiedai, kurių pagalba galima fiziškai atskirti koloniją nuo kitų ląstelių.  Tuomet ląstelės gali būti fermentiškai atkabintos ir perkeltos iš klonavimo žiedo panaudojant mikropipetę. Alternatyvus metodas – medvilniniu tamponu švelniai nugremžti koloniją ir taip izoliuoti klonus. Prie medvilnės prikibusios ląstelės perkeliamos tamponą panardinus į terpę. Vis dėlto, industrinėse sąlygose šiuos tradicinius metodus keičia ląstelių rūšiavimas ir robotų technika, sumažinanti kandidatinių ląstelių linijų tikrinimui reikalingą darbo krūvį.

Produkuojant didelius baltymo kiekius, kaip kad monokloninių antikūnų atveju, ląstelių linijos, kurių produktyvumas mažesnis negu 20 pg/ląst./dieną, yra išmetamos. Norint patikrinti itin produktyvias ląstelių linijas, reikia vykdyti daugybinius transfekcijos eksperimentus, kadangi transfekuotose populiacijose individualios integracijos dažnis yra mažas. Iš vienos transfekuotos plokštelės retai gaunama daugiau nei 500 ar 1000 stabilių ląstelių linijų. Taigi, tikrinimo proceso mastai skiriasi nuo kitų sistemų. Be to, tikrinant produkuojančius kandidatus reikia atsižvelgti ir į ląstelių augimą. Paprastai itin aukšto specifiškumo produktyvumas yra būdingas lėtai augančioms ląstelių linijoms. Tačiau plataus masto bei gamybiniams tikslams tinkamos ląstelių linijos turi pasižymėti greito augimo ir aukšto specifiškumo produktyvumo kombinacija. Yra atliekami tyrimai, siekiant nustatyti, kaip augimas ir produktyvumas imortalizuotose ląstelių linijose sąveikauja tarpusavyje.

Taip pat svarbu atsižvelgti į kloninių ląstelių linijų stabilumą ilgai trunkančiu laikotarpiu. Imortalizuotų ląstelių linijoms būdingas genetinis, o tuo pačiu ir fiziologinis, heterogeniškumas reikalauja atidžiai išanalizuoti produkcijai skirtas šeimininko ląsteles prieš patvirtinant jas stabiliomis. Tokiam darbui gali prireikti keletą mėnesių trunkančių tyrimų. Pavyzdžiui, GS-NS0 sistemoje selekcinio preparato MTX taikymas kultūrose gali kai kuriose ląstelių linijose išlaikyti stabilų fenotipinį pavidalą, tačiau buvo atlikti genetiniai tyrimai, parodę, kad preparatas skatina nepageidaujamą citogenišką heterogeniškumą, ypač reguliaciniuose šeimininko linijos procesuose. Taigi, gali būti naudinga pašalinti selekcinius preparatus iš karto po to, kuomet daug žadančios kloninės ląstelių linijos yra identifikuojamos.

Rekombinantinių baltymų produkcijai žinduolių ląstelėse daugiausiai yra taikomi du kultivuojamų ląstelių formatai: adhezinės ląstelių kultūros ir suspensinės ląstelių kultūros. Pastarasis metodas yra labiau paplitęs. Eritropoetinas (Epogenas) buvo pirmasis rekombinantinis baltymas, produkuotas žinduolių ląstelėse, pasiekęs įspūdingus pardavimus, siekiančius 1 bilijoną JAV dolerių kasmet. Epogeno produkcijai buvo panaudota gana paprasta technologija. CHO ląstelės buvo užsėtos sukamuosiuose cilindruose, kurie buvo 10-30 % pripildyti terpės ir lėtai sukami, kad ląstelės galėtų prilipti. Sukimas užtikrino pastovų ląstelių drėkinimą, o deguonis buvo tiekiamas pro erdvų cilindrinių butelių kaklelį. Paauginus ląstelių kultūrą ir leidus joms pasiekti konfluenciją po keleto dienų, produktas buvo surenkamas iš nupilto supernatanto. Proceso mastas gali būti nesunkiai padidintas, kadangi jį lemia paraleliai naudojamų sukamųjų cilindrų kiekis. Produkto koncentracijos siekė 50-200 mg/l, taigi buvo galima gauti kilograminius produkto kiekius kasmet. Mažai tikėtina, kad tokio tipo proceso metu būtų galima gauti gramus/litre produkto kiekio, kadangi ląstelių/tūrio santykis tokioje sistemoje daug mažesnis negu optimizuotuose maišomo skyriaus reaktoriuose. Šiais laikais Epogeno gamybinis procesas išlieka pamatine gamybine procedūra, pagal kurią visi esminiai apdorojimo etapai, įskaitant ląstelių užsėjimą, butelių pripildymą terpe bei ląstelių kultūros skysčių surinkimą, yra atliekami filtruoto oro aplinkoje be žmogaus dalyvavimo.

Adhezinės ląstelės taip pat buvo kultivuojamos ant polimerinių sferų, vadinamųjų mikronešiklių, kurie palaikomi suspensijoje maišomo skyriaus reaktoriuose. Tokiu būdu galima nesunkiai padidinti mastą bioreaktoriuose. CHO ląstelės ant mikronešiklių buvo panaudotos folikulą stimuliuojančio hormono ir virusinių vakcinų produkcijai.

CHO ląstelės dominuoja rekombinantinių baltymų masinės produkcijos srityje, kadangi gali būti auginamos pavienių ląstelių suspensijoje. Tarp kitų ląstelių linijų, galinčių augti suspensijoje, yra iš pelių mielomos išskirta NS0, BHK, HEK-293 ir iš žmogaus tinklainės išskirta PER-C6. Be ląstelių, išskirtų iš kraujo (NS0), dauguma ląstelių linijų išlaiko savo polinkio prisitvirtinti savybę, jeigu nėra dedama specialių pastangų adaptuojant jas prie suspensinio auginimo. Perėjimas nuo adhezinių ląstelių prie suspensinio kultivavimo buvo sudėtingas 1980-aisiais. Šiuo metu komerciškai prieinamos terpės šį perėjimą gerokai palengvina. Vis tik, reikia įdėti pastangų tikrinant keletą skirtingų terpių, skatinančių šį perėjimą. 

Gaminant paprastą seriją arba padidintos serijos procese mastą padidinti galima skiedžiant bioreaktoriaus turinį 5-20 kartų su šviežia terpe iš didesnio reaktoriaus. Visas procesas, pradedant saugomų ląstelių atšildymu ir baigiant produkuojančiais indais, susideda iš trijų atskirų fazių: užsėjimo, inokuliavimo ir produkcijos fazių. Užsėjimas paprastai atliekamas nedideliais mastais, siekiant paruošti šviežias ląsteles tolimesniam jų padauginimui pasirinktam produkcijos laikotarpiui. Inokuliavimas prasideda nedideliais ląstelių suspensijos kiekiais iš užsėtų ląstelių, tuomet šis kiekis yra didinamas iki pakankamo ląstelių kiekio galutinei produkcijos fazei. Tam tikrai ląstelių linijai optimizuotos proceso sąlygos negali būti laikomos optimaliomis apskritai, kadangi žinduolių ląstelių linijos pasižymi itin individualiomis savybėmis, kurias ypač išreiškia skirtingi gliukozės suvartojimo greičiai, laktato produkcijos greičiai ir skirtingas jautrumas streso signalams.

Nors kultūros auginimo laikas (iki produkto surinkimo) priklauso iš esmės nuo gamybinių pajėgumų ir produktyvumo kinetikos, svarbus veiksnys yra ir gautojo produkto kokybė. Nuolatos besikeičianti kultūros terpės sudėtis produkcinės fazės metu gali paveikti ankščiau susintetinto produkto kokybę dėl ląstelių išskirtų fermentų degradacinio aktyvumo. Taip pat mažėjantis maisto medžiagų kaip energijos šaltinio ar statybinių blokų tiekimas sintezuojamam produktui gali pakeisti jo molekulinę sudėtį. Kaip bebūtų, reprodukcinio proceso metu yra produkuojamos baltymų molekulės su apibrėžtomis molekulinių skirtumų ribomis.

Proceso optimizavimas vyksta masto mažinimo sistemose. Populiariausio ir plačiausiai naudojamo masto mažinimo reaktoriaus talpa siekia 1-2 litrus. Tačiau reaktorius galima pakeisti neinstrumentinėmis sistemomis. Užpildžius 30-50 % flakonų su maišytuvais talpos gaunama 200-5000 ml. Ląstelių kultūrose flakonuose su maišytuvais dažnai atsiranda deguonies trūkumo požymių, ypač auginant ląsteles dideliais tankiais. Purtomi daugiašulinėliniai pleitai taip pat naudojami kaip masto mažinimo sistemos, tačiau šiuo atveju gana intensyviai vyksta garavimas, todėl jų panaudojimas ribotas, ypatingai prailgintos produkcijos kultūroms. Kratomi 50 ml centrifuginiai mėgintuvėliai su ventiliaciniais kamšteliais buvo pradėti naudoti gana neseniai, bet jau tapo daug žadančiomis masto sumažinimo sistemomis, kuriose augimas ir produktyvumas panašus į tą, kuris būdingas reaktoriams. 

Žinduolių ląstelių kultivavimas bioreaktoriuose pralenkė mikrobines sistemas savo klinikinių produktų mastu. Atsiradus sudėtingų ir modifikuotų baltymų poreikiui, mokslas ir technologijos atskleidė produkcinėmis sąlygomis kultivuojamų žinduolių kamieninių ląstelių biologijos principus. Šių principų suvokimo pagrindinė nauda – galimybė gauti didesnius ląstelių kiekius, net esant nedidelės partijos kultūros auginimo sąlygomis. Tendencija didinti ląstelių tankį reaktoriuose ir toliau išlieka bei skatina ieškoti galimybių pakelti produktyvumą dar labiau. Siekiant gauti didesnius ląstelių kiekius yra reikalingi tik nedideli reaktoriaus inžinerijos ir valdymo patobulinimai (pvz., naudoti gryną deguonį vietoj oro). Vis dėlto, padidėja svarba, kontroliuojant terpės sudėtį reaktoriuje bėgant laikui.

Rekombinantinių baltymų išgryninimas chromatografiniais metodais

Baltymų produkcijos reikalavimai vis didėja, tiek industriniams, tiek moksliniams tikslams. Dideli rekombinantinių baltymų kiekiai reikalingi moksliniams tyrimams, vaistų kūrimui, biofarmacinei produkcijai ir didelio masto tikrinimo procedūroms. 200 rekombinantiniais baltymais paremtų biofarmacinių medžiagų yra suteiktas žmonių terapinis ir/arba diagnostinis leidimas, o dar daugiau nei su 350 šiuo metu atliekami vėlyvosios fazės klinikiniai tyrimai. Nors naudojant šiuo metu taikomas strategijas gaunami nemaži baltymo kiekiai (iki dešimčių gramų litre), svarbu yra užtikrinti visų nešvarumų pašalinimą ir pakankamus kiekius išgryninto baltymo, skirto atitinkamiems poreikiams. Visų pirma, dėl ekonominių priežasčių išaugę baltymo produkcijos kiekiai pakreipė tyrimus nuo produkcijos optimizavimo prie baltymo išgryninimo procesų. Su baltymo išgryninimo susijusiais procesais šiuo metu yra skiriama 45-92 % bendros rekombinantinio baltymo pagaminimo kainos. Taigi, pagrindinis iššūkis šiuo metu yra sukurti efektyvią ir ekonomišką išgryninimo metodiką. Tai ypač aktualu industrinės produkcijos atžvilgiu.

Afininė chromatografija. Bene plačiausiai baltymo išgryninimui yra taikomi chromatografiniai metodai. Afininės chromatografijos metodika rekombinantinių baltymų išgryninimui gali būti taikoma įvairiais būdais. Labiausiai įprastas pavyzdys yra baltymo-A chromatografija. Ši metodika buvo pritaikyta prieš daugiau nei dešimtmetį industriniams ir moksliniams tikslams, siekiant surinkti ir išgryninti antikūnus (imunoglobulinus). Nepaisant keleto trūkumų, susijusių su galimu baltymo-A nutekėjimu į judriąją fazę, ir didelės kainos, ši metodika tebėra plačiai naudojama didelio masto monokloninių antikūnų išgryninimui (įskaitant ir naudojamus terapiniams tikslams). Komerciškai prieinamos rekombinantinio baltymo-A dervos pasižymi didele prisijungimo geba ir gali atlaikyti šiurkščias sterilizavimo sąlygas, taikomas industriniuose procesuose. Nepaisant akivaizdžių trūkumų, baltymo-A panaudojimu pagrįstos metodikos yra labai naudingos industriniams poreikiams dėl savo gebėjimų netiesiogiai pašalinti virusus (tokius kaip SV40, XmuLV ir MMV). Be to, galimybė surinkti monokloninius antikūnus tiesiogiai iš gryninamos produkcijos be išankstinio apdorojimo ir labai didelis selektyvumas, padedantis pašalinti didžiają dalį šeimininko baltymų, yra du atskiri baltymo-A paremtos metodikos privalumai. Kita afiniškumu paremta metodika, leidžianti nesudėtingą rekombinantinių baltymų išgryninimą yra susiliejimo žymenų panaudojimas. Susiliejimo žymenys – tai aminorūgščių sekos, prikabintos prie rekombinantinių baltymų, pasižyminčios aukštu ir selektyviu afiniškumu cheminiams ar biologiniams ligandams, kurie imobilizuoti chromatografinėje kolonėlėje. Tokiu būdu galima nesunkiai išgryninti rekombinantinį baltymą. 

Kaip jau buvo minėta, rekombinantinių baltymų išgryninimui iš bioproceso metu gautų mišinių itin dažnai naudojami histidino žymenys. Šį žymenį sudaro šešių ar daugiau histidino liekanų seka, kuri prikabinama prie dominančio rekombinantinio baltymo N arba C galo. Seka pasižymi dideliu afiniškumu tokiems metalo jonams kaip nikelis ar cinkas. Šiuo atveju naudojama imobilizuota metalų afininė chromatografija (IMAC), kuomet panaudojant specialią matricą galima sujungti metalus ir prie metalų besijungiančias histidino liekanas bei išgryninti rekombinantinį baltymą. Šiuo atveju baltymas išgryninamas eliucijos būdu arba panaudojant chelatus, pvz., imidazolą. IMAC paprastai naudojamas kaip baltymų išgryninimo metodas moksliniams bei industriniams poreikiams. Be to, su keletu IMAC metodu išgrynintų terapinių medikamentinių baltymų šiuo metu atliekami klinikiniai tyrimai. Natūraliai esantys metalūs besijungiantys baltymai ir histidinu bei cisteinu gausios sritys nereikalinguose baltymuose konkuruoja su pažymėtais baltymais, prisijungia prie kolonėlės ir interferuoja su IMAC, dėl to dažnai galutinis produktas būna užterštas. Vis dėlto, šis metodas dažnai naudojamas histidinu pažymėtų rekombinantinių baltymų išgryninimui, kurio metu gaunami iki 95 % grynumo produktai. Be to, skirtingai nei daugelis kitų biologinių afiniškumo metodų, IMAC nėra veikiamas proteazių aktyvumo. Histidinu pažymėti baltymai gali būti išplaunami iš IMAC švelniomis eliucijos sąlygomis, o tai išsaugo rekombinantinių baltymų aktyvumą ir/arba natyvų susilankstymą. Kaip bebūtų, galimas metalų pratekėjimas iš kolonėlės gryninimo metu gali kelti problemų, o to patikrinimas reikalautų papildomų išlaidų. Be to, histidino žymenų pašalinimui reikėtų brangių proteazių ir papildomų chromatografinių etapų galutinio baltymo išgryninimui, kas dar labiau padidintų kainą. 

Alternatyvūs žymenys (pvz., FLAG, Softtag1 ir Softag2) jungiasi prie specifinių monokloninių antikūnų prieš juos. Šiuos žymenis galima panaudoti žymėtų baltymų imunoišgryninimui. Tačiau, su monokloninių antikūnų naudojimu susijusios padidintos išlaidos, o daugybinių gryninimo ciklų metu taikomos šiurkščios chromatografinės sąlygos gali turėti žalingą poveikį antikūnų prisijungimui prie jų antigenų. Strep tag II yra oktapeptidas (WSHPQFEK), atpažįstantis streptavidiną ir gali būti išplaunamas iš kolonėlės su streptavidinu, naudojant biotino analogus. Taigi, šį žymenį galima naudoti gryninant baltymus iš skirtingų šeimininko sistemų. Šiuos žymenis galima pašalinti proteolitiškai atskėlus sritį tarp ligando ir analito, o analitą praleidus pro žymenį besijungiančią kolonėlę antrą kartą galima gauti gryną baltymą be nespecifiškai prisijungusių darinių ar proteazių. Tačiau, kaip jau minėta, šios proteazės yra brangios ir tokių žymenų naudojimas padidina apdorojimo kainą.

Medikamentinių baltymų tolimesnis apdorojimas dažniausiai atspindi pagrindinę baltymo gamybinę kainą, todėl idealiausia naudoti vieno etapo rekombinantinio baltymo atskyrimo procedūrą, taikant didelio selektyvumo ir stabilumo afininius ligandus. Afininė chromatografija baltymų išgryninimui naudojama daugelį metų, o pastaruoju metu padarytas progresas taikant kombinatorinius ir naujus ligandus yra daug žadantis. Reikiamų baltymų išgryninimui naudojamų ligandų pasirinkimas gali būti atliekamas pagal įvairius būdus – atsižvelgiant į baltymų struktūrą, funkcijas arba taikant kombinatorinius sprendimo būdus. Pavyzdžiui, naudojant bakteriofagus, ribosomas ar eksponentinio praturinimo sisteminės ligandų evoliucijos metodą (SELEX). 

Kuomet ligandai taikomi atsižvelgiant į žinomą baltymo trimatę struktūrą, ligando prisijungimo sritis nustatoma pagal žinomą aktyvią sritį, į paviršių-tirpiklį eksponuojamą sritį arba naudojant sritį, prie kurios ligandas natūraliai jungiasi. Kuomet dominančio baltymo struktūra nėra žinoma, ligandas pasirenkamas atsižvelgiant į baltymo funkcijas. Pavyzdžiui, Cibrakono mėlis 3GA įgyja nukleotidams būdingas konformacijas ir gali būti naudojamas nukleotidus prisijungiančių baltymų išgryninimui. Taip pat, kaip afiniškumo žymenys gali būti naudojamos biomimetinės medžiagos, kurios atkartoja žinomus baltymo substratus, inhibitorius ar kofaktorius. Įvairios kompanijos teikia komerciškai prieinamus dažų adsorbentus, skirtus baltymų gryninimui. Sintetinių peptidų ar fagų/ribosomų bibliotekos naudojamos identifikuojant peptidinius ligandus, besijungiančius prie dominančio baltymo su aukštu afiniškumu. Remiantis šiais metodais, sintetinių peptidų biobliotekoje buvo identifikuotas heksapeptidas (FLLVPL), kuris buvo panaudotas žmogaus fibrinogeno gryninimui. SELEX metodu buvo identifikuotas DNR aptameras, kurį panaudojus buvo išgrynintas žmogaus L-selektino-imunoglobulino susiliejimo baltymas, ekspresuotas CHO ląstelėse. Mažamolekuliniai žymenys yra geresni ligandai nei biomolekulės, kadangi jie atlaiko šiurkščias sterilizacijos sąlygas. Tačiau mažamolekuliniai ligandai pasižymi mažesniu specifiškumu, dėl ko kartu išgryninami ir kiti faktoriai ir procesas tampa ne toks produktyvus. Tai yra jų pagrindinis trūkumas nuolatiniam naudojimui. Nors afininė chromatografija dėl savo selektyvumo ir afiniškumo gali būti labai naudingas metodas, rekombinantinių baltymų gryninimui niekada netaikomas vien tik jis, kadangi dažnai tinkamų ligandų pasirinkimas yra prastas, o taip pat išlieka endotoksinų ir glikoformų kontaminacijos grėsmė. 

Jonų mainų chromatografija. Jonų mainų chromatografija (angl. Ion-exchange chromatography; IEX) išlieka vienu dažniausiai taikomų pirminiu etapu baltymų atskyrimui pramoniniuose procesuose, o taip pat ir didžiojoje dalyje mokslinių procesų, kuomet dominantis baltymas nėra pažymėtas ir nėra monokloninis antikūnas. Tam yra daug priežasčių, pavyzdžiui tai, kad baltymai yra amfoterinės molekulės ir bet kuris baltymas prisijungs prie jonų mainų dervų, priklausomai nuo tirpalo pH. IEX metodu pasiekiama aukšta rezoliucija esant švelnioms išgryninimo sąlygoms, o prisijungimo geba išlieka stipri. Prisijungimui ir eliucijai naudojamo buferio pH veikia silpnų jonų mainų molekulių krūvius, tačiau stiprios jonų mainų molekulės savo krūvį išlaiko nepakitusį esant plačioms pH riboms. Taigi, jie dažniausiai naudojami komercinių bioprocesų tikslams. Prieš taikant plataus masto produkciją paprastai atliekami pilotiniai tyrimai, kuriais nustatoma dominančio baltymo jungimasis prie pasirinktų molekulių ir skirtingų joninių koncentracijų bei pH poveikis. Eliucija yra atliekama keičiant tirpalo pH arba joninę jėgą, o kadangi pH pokyčio atkuriamumas yra mažesnis, paprastai sukuriamas didelio masto druskų gradientas. Teoriškai bet kuri druska gali būti naudojama eliucijai, kadangi jos visos moduliuoja elektrostatines tarpusavio sąveikas, o tuo pačiu ir prisijungimą bei eliuciją.

Naudojamos druskos sukeltas vadinamasis „išsodinimo“ poveikis baltymui, jos valentingumas ir jonų jungimasis prie baltymų apibrėžia druskos eliucines savybes, ir paaiškina, kodėl tų pačių valentingumų druskos pasižymi skirtingomis eliucinėmis savybėmis. „Išsodinimas“ gali sukelti stipresnį prisijungimą prie IEX dervų, todėl eliucijai yra labiau pasirenkamos silpną „išsodinimo“ poveikį baltymams turinčios druskos, kaip kad natrio chloridas, o ne stipriu išsodinimu pasižyminčios druskos, kaip kad amonio sulfatas. Kaip kad buvo parodyta su monokloninių antikūnų ir kitų rekombinantinių baltymų išgryninimo tyrimais, jonų mainai gali būti intensyviai naudojami agregatų pašalinimui. Be to, mažinant agregatų formavimąsi eliucijos metu efektyviau veikia prisijungimo buferiai su 0,15-0,2 M arginino koncentracijomis, negu tokios druskos kaip citratas ir natrio chloridas. Net jeigu norimus baltymus besijungiančios dervos yra sudarytos iš katijonų mainų (CEX) molekulių, anijonų mainų (AEX) molekulės dažnai naudojamos kartu tam, kad būtų pašalinti DNR ir lipopolisacharidų (LPS) nešvarumai. Paprastai IEX, kaip ir kitiems chromatografiniams metodams, yra reikalingi gryninami mėginiai be ląstelių ar ląstelinių nuolaužų, taigi šalia reikalingi centrifugavimo arba filtravimo metodai, kurie gali būti brangūs ir/arba reikalaujantys laiko. 

Hidrofobinė chromatografija. Hidrofobinė chromatografija (HIC) yra populiarus baltymų išgryninimo metodas, kurio atveju, panašiai kaip ir taikant kitas chromatografines metodikas, išgryninimo proceso dizainą labai palengvina galimybė integruoti į procesą matematinį modeliavimą  ir apskaičiuoti dominančio baltymo hidrofobiškumą. Baltymai jungiasi prie hidrofobinių HIC ligandų, priklausomai nuo jų hidrofobiškumo, kuris taip pat nurodo ir baltymų atskyrimo sąlygas (kaip kad atitinkamo baltymo išsilaikymą), o tuo pačiu ir HIC atlikimo sąlygas. Baltymo hidrofobiškumas nustatomas pagal baltymą sudarančias amino rūgštis, panaudojus didelės koncentracijos druskas (pvz., amonio sulfatą), eksponuojant jas hidrofobiniuose paviršiuose taip, kad baltymai galėtų jungtis prie HIC kolonėlės. Eliucija tuomet yra vykdoma panaudojant mažėjantį druskų gradientą. Tai daro šį metodą itin patraukliu, kadangi eliuatas ir precipitatas pasižymi didelėmis druskų koncentracijomis, o tai skatina jungimąsi prie HIC dervų. Baltymų hidrofobiškumą, o tuo pačiu ir jų išsilaikymą prie atitinkamų HIC dervų, galima nustatyti teoriniais metodais. Be to, amino rūgštys (glicinas ir argininas), polioliai (etileno glikolis ir glicerolis) ir cukrūs (cukrozė) taip pat moduliuoja baltymų prisijungimą ir eliuciją iš HIC. „Išsodinančių“ druskų naudojimas sukelia prastą baltymų atgaminimą, o stipresnių sąlygų taikymas sukelia baltymų denatūracijos grėsmę. Norint apeiti šią problemą, gali būti naudojami tirpiklio moduliatoriai. Pavyzdžiui, buvo parodyta, kad iki tam tikrų kritinių koncentracijų argininas gali susilpninti baltymo jungimąsi prie HIC dervų ir gali būti panaudotas interleukino-6 ir monokloninių antikūnų eliucijai. Kai kuriais atvejais arginino poveikis gali būti itin dramatiškas. Pavyzdžiui, aktivino atveju. Kadangi aktivinas yra lipnus baltymas, jo nepavyko išplauti iš HIC kolonėlės panaudojant mažas citrato koncentracijas ir net 20 % etanolio. Tačiau panaudojus 0,5 M arginino tirpalą baltymo atgaminimas siekė 60 %. Apibendrinus, HIC gali būti naudojama rekombinantinių baltymų, homologinių baltymų ar antikūnų atskyrimui, o kadangi pats HIC atskyrimo principas skiriasi nuo IEX ir kitų gryninimo metodų, siekiant išgryninti baltymus iš itin sudėtingų biologinių mėginių, galima naudoti jį kartu su kitais metodais. Be to, kadangi HIC naudojamos didelio druskingumo prisijungimo sąlygos, o IEX tokios sąlygos naudojamos eliucijai, HIC gali būti naudojamas kaip kitas etapas po IEX, kuomet net nereiktų pakeisti buferio.

Multimodalinė chromatografija. Multimodalinės chromatografijos metodas taip pat buvo neseniai išvystytas ir pritaikytas įvairiems išgryninimo procesams. Kadangi tirpinio prisijungimui nėra reikalinga didelė joninė jėga, eliucija nesudėtinga, o šio metodo selektyvumas unikalus, jis darosi vis populiaresnis pramoniniuose baltymo gryninimo procesuose. Multimodalinės chromatografijos selektyvumas pasireiškia dėl elektrostatinių, hidrofoninių tarpusavio sąveikų bei vandenilio prisijungimo, o visa tai priklauso nuo konkretaus atvejo. Tradicinis multimodalinės chromatografijos pavyzdys yra hidroksiapatito (HA) chromatografija. Šiuo atveju baltymas jungiasi per HA-fosforilo (katijoniniai mainai) arba HA-kalcio (metalų afiniškumas) liekanas. Maži baziniai baltymai paprastai jungiasi prie HA per fosforilo-kationų mainus, o rūgštiniai baltymai dažniausiai sąveikauja per kalcio afiniškumą. Tačiau dideli baltymai gali jungtis naudodami abu mechanizmus. HA gali būti mikrokristalinės formos arba kaip sferinės dalelės. Mikrokristalinis HA nėra mechaniškai stabilus, todėl gali būti naudojamas tik partijos gamyboje, tuo tarpu sferinės dalelės gali būti naudojamos daugybinių ciklų metu.  

Populiarus HA, naudojamas rekombinantinių baltymų gryninimui (pvz., antikūnų) yra keraminis HA (CHT). HA chromatografija taip pat labai naudinga šalinant baltymų agregatus iš mėginio. Be to, polietileno glikolio (PEG) buvimas jungimosi buferyje sustiprina baltymo išsilaikymą HA kolonėlėje ir tai vyksta proporcingai dominančio baltymo dydžiui. Dėl to baltymų agregatai kolonėlėje užsilaiko ilgiau negu jų monomerai ir tokiu būdu agregatai gali būti nesunkiai pašalinami. Buvo parodyta, kad naudojant CHT galima švariai atskirti baltymą-A iš ankstesnio chromatografijos etapo, DNR, endotoksinus, virusus, šeimininko ląstelės baltymus ir agregatus nuo monomerinio imunoglobulino G (IgG), o tai rodo šio metodo efektyvumą. Vis dėlto, mechaniškas nestabilumas, prastas tinkamumas pakartotiniam panaudojimui ir didelės kainos sudaro CHT chromatografijos trūkumus.

Esama taip pat daugybės kitų dervų, naudojamų multimodalinėje chromatografijoje. Nemažai kompanijų vis išleidžia į rinką savas multimodalines dervas. Kadangi pasirodo vis daugiau dervų tipų su unikaliu selektyvumu ir geresnėmis prisijungimo gebomis, multimodalinė chromatografija ateityje galimai bus dažniau naudojama gryninant baltymus mokslo ar pramonės tikslams.

Dydžių ekskliuzinė chromatografija. Dydžių ekskliuzinė chromatografija (angl. size exclusion chromatography; SEC) atskiria molekules pagal jų hidrodinaminį stiprumą ir yra naudojama baltymų išgryninimui jau keletą dešimtmečių. Šiuo atveju, didesnės molekulės užsilaiko trumpiau negu mažesni analitai ir ši savybė sudaro sąlygas efektyviam atskyrimo procesui, jeigu tyrimo metodai yra optimizuoti. Tas pats principas gali būti panaudotas norint nudruskinti ar pekeisti baltymų tirpalo buferį kitu buferiu. Skirtingų dydžių molekulių atskyrimas priklauso nuo dervų porų dydžio, stovo aukščio, tekėjimo greičio, mobilios fazės sudėties ir mėginio dydžio. Stacionarios SEC fazės paprastai pasižymi prastesne geba atskirti skirtingų dydžių molekules. Taigi, reikia kruopščiai atsirinkti tinkamą stacionarią fazę, ypač atsižvelgiant į dominančios molekulės dydį ir nereikalingus taršalus. Mobiliosios fazės sudėtis veikia baltymo užsilaikymo laiką ir vėlesnį jo atskyrimą. Baltymai sąveikauja su stacionarios fazės molekulėmis elektrostatinėmis ir hidrofobinėmis sąveikomis, kurios prailgina jų užsilaikymą, dėl ko jų atskyrimas sumažėja, o tai gali būti nepageidautina. Mobiliosios fazės pH sumažėjimas sumažina rūgštinių baltymų jonizaciją. Tuo tarpu žema jonizacija sumažina stacionarios fazės ir rūgštinių baltymų tarpusavio sąveiką. Mobilios fazės pH gali būti pasirenkamas atsižvelgiant į dominančio baltymo prigimtį bei į taršalus taip, kad taršalų užsilaikymo trukmė būtų prailginta, o dominančio baltymo sumažinta, arba atvirkščiai. Kitas užsilaikymo trukmę įtakojantis faktorius yra joninė jėga. Didelės fosfatų koncentracijos ir vidutinės natrio chlorido koncentracijos mažina elektrostatines baltymų ir stacionarios fazės sąveikas. Tačiau, didelės koncentracijos, pavyzdžiui, amonio sulfato, gali sustiprinti baltymo adsorbciją prie stacionarios fazės per hidrofobines sąveikas, kurios didina užsilaikymo trukmę. Organinių tirpiklių, kaip kad acetonitrilo, buvimas mobilioje fazėje gali sumažinti šias sąveikas, tačiau taip pat gali denatūruoti dominantį baltymą, dėl ko agregatai gali formuotis nepamatuotais kiekiais. 

Dėl savo prastos rezoliucijos ir puikių nudruskinimo savybių SEC daugiausiai naudojamas kaip galutinis valymo etapas, kuomet kiekis sumažintas, o agregatų pašalinimas ir tirpalo pakeitimas yra būtini. Be to, SEC reikia labai nedidelių mėginio kiekių, todėl reikalingas koncentravimo etapas, o tai didina proceso kainą. Norint pasiekti gerą atskyrimą naudojant SEC, yra reikalingos didelės kolonėlės, o dėl slėgio apribojimo reikalingi nedideli tėkmės greičiai. Neatsižvelgus į šiuos faktorius sumažėja SEC produktyvumas, todėl tai ir yra pagrindiniai metodo trūkumai, norint jį taikyti pramoniniams tikslams. Taikant aukšto lygio tangentinės tėkmės filtravimą taip pat galima atlikti koncentravimą ir buferio pakeitimą vieno etapo metu, todėl ši metodologija pamažu išstūmia SEC iš pramoninio apdorojimo. Kaip bebūtų, SEC yra plačiai naudojama kaip analitinė metodika, siekiant išmatuoti ir monitoruoti agregatų kiekį mėginyje.

Baltymų gryninimas ne chromatografiniais metodais

Lauko asistavimo ir elektroforetinio atskyrimo metodai. Kaip jau minėta, baltymo gryninimo procesai sudaro didžiąją kainos dalį, gaminant biofarmacinius preparatus. Todėl nuolatos ieškoma naujų, pagerintų ir ekonomiškesnių baltymų atskyrimo metodų. Gryninant baltymus gali būti naudojami elektriniai, akustiniai ir magnetiniai laukai, juos derinant su jau žinomais metodais arba atskirai. Taikant magnetinį lauką, biomakromolekulės pasižymi feromagnetizmu, paramagnetizmu ir diamagnetizmu. Mėginio terpė kartais gali būti užteršta ląstelėmis, kurias reikia atskirti nuo dominančio baltymo. Magnetinės dalelės su afiniškumo ligandais ląstelėms gali būti įdėtos į terpę ir atskirtos magnetu. Šis metodas rutiniškai naudojamas mikrobinių ląstelių atskyrimui iš terpės. Afiniškumu grįsti magnetiniai metodai gali būti naudojami ir atskiriant baltymus, DNR ar RNR iš terpės ar biologinių mėginių (Pav. 3).

3

Pav. 3. Magnetinis makromolekulių atskyrimas iš  sudėtinių mišinių. Pagal Saraswat, 2013.

Kita lauko asistavimu paremta technologija, vadinamoji laisvos tėkmės elektroforezė (angl. free-flow electrophoresis; FFE) gali būti naudojama baltymų ir ląstelių gryninimui iš įvairių šaltinių, įskaitant įvairius žmogaus mėginius (pvz., šlapimą ar serumą). FFE pasižymi tam tikrais privalumais, lyginant su chromatografiniais metodais, tai – nuolatinis mėginio injekavimas bei galimybė atskirti neapdorotus ekstraktus, kuriuose gausu ląstelių ar subląstelinių dalelių. Kita vertus, esama tam tikrų trūkumų, tokių kaip specialios instrumentuotės poreikis ar būtinybė optimizuoti daugybinius parametrus sudėtingų mėginių analizei. Frakcionuojant žmogaus plazmą FFE metodu buvo išgrynintas IgG vieno etapo metu su 79 % atgaminimu ir klinikinio lygio grynumu (IVIG lygis). To paties tyrimo metu, procesą atlikus dviem etapais, buvo pasiektas 93 % atgaminamumas ir 98,8 % grynumas, o mastas galėjo būti padidintas iki 100 kartų. Rekombinantinis žmogaus augimo hormonas (rhGH) buvo išgrynintas (98 % grynumu, 90 % atgaminamumu) iš CHO ląstelių terpės vieno etapo metu, atliekant gradualinę tėkmės preparacinę elektroforezę ir panaudojant 50 kDa atskyrimo membraną. Tai rodo elektroforezės galią atskirti baltymus. Gradualinės tėkmės preparacinės elektroforezės mastą galima nesunkiai padidinti, taigi, šiuo metodu gali būti išgryninti dideli rekombinantinių baltymų kiekiai. Preparacinė elektroforezė yra galingas baltymų išgryninimo metodas ir, nors ne itin naudojamas plataus masto baltymų gryninimui, jis sulaukia vis didesnio susidomėjimo dėl savo aukštos rezoliucijos ir galimybės atlikti nepertraukiamą atskyrimą, o tai rentabilumo požymis. 

Membrana grįstos sistemos. Membranos – tai tokie sąlyčio paviršiai, kurie veikia kaip barjeras tarp skysčio-skysčio ir skysčio-dujų fazių bei jungia sąlyčio puses. Membranos yra plačiai naudojamos biotechnologijoje baltymų gryninimui/koncentravimui, priklausomai nuo dominančių baltymų dydžio ir/arba krūvio. Be to, jų naudojimas pasižymi kertiniais privalumais, susijusiais su kaina ir nesudėtingu masto padidinimu ir šiuo atžvilgiu jos pranoksta chromatografinius metodus. Šiuo metu membrana grįstos sistemos yra rutiniškai naudojamos pramoniniais ir moksliniais tikslais tolimesniam rekombinantinių baltymų apdorojimui. Plačiausiai membranos naudojamos su slėgio panaudojimu susijusiuose procesuose, tokiuose kaip ultrafiltravimas (UF), mikrofiltravimas, virusų filtravimas ir nanofiltravimas. Ultrafiltravimui naudojamos membranos dažniausiai yra 1-20 nm dydžio, o jų baltymų išlaikymas yra labai didelis. Daugiausia jos naudojamos baltymų koncentravimui ir buferio pakeitimui ir šiuo atžvilgiu pramoniniu mastu naudojamos labiau negu SEC. Membranų pralaidumą apsprendžia porų dydis, poriškumas, storis ir tirpiklio savybės. Bet koks ant membranų esantis krūvis pakeis pačią tėkmę ir, atitinkamai, baltymo praėjimą pro membraną. Membranos hidrofobiškumas taip pat yra svarbus, kadangi sumažina tėkmę ir proceso permeabiliškumą dėl baltymų adsorbcijos. Polietersulfono (PES) membranos yra hidrofobiškesnės negu celiuliozinės membranos. Membranos nešvarumas pasižymi panašiu poveikiu proceso pralaidumui ir veikia kaip apribojimas UF atveju. Pastaruoju atveju buvo sukurta daug įvairių modulių, kaip tuščiaviduris vamzdelis, spiralinis apsukimas, plokščiasluoksnės kasetės ir vamzdeliniai moduliai. Greta geresnių masės perkėlimo savybių, šiais moduliais galima atskirti užsilaikiusias ir filtruojamas sroves, taip pat jie teikia mechaninę atramą bei lengvą priėjimą valymo ir pakeitimo tikslais.

Nors UF yra rutiniškai naudojamas pramonėje baltymų koncentravimui ir buferio pakeitimui, baltymų atskyrimas, taikant tik vieną UF etapą, tebėra iššūkis. Vis dėlto, esama daug pavyzdžių, kuomet UF metodu buvo išgryninti rekombinantiniai baltymai su dideliu švarumu ir atgaminamumu. UF membranos gali taip pat būti pagamintos iš poliakrilonitrilo, celiuliozės bei celiuliozės acetato ir keramikos. Įprastos UF membranos paprastai skiriasi nuo baltymų savo dydžiu ir šis skirtumas turi būti bent dešimties kartų, norint efektyviai atskirti baltymus. Tačiau, membranos, turinčios krūvius, geriau atskiria tokius baltymus, kaip mioglobinas, jaučio serumo albuminas (BSA) ir rekombinantinį antigeną besijungiantį fragmentą (Fab) bei viso dydžio antikūnus.  

Baltymų gryninimui taip pat gali būti taikomas elektrinio lauko ultracentrifugavimas (EUF). EUF taip pat taikomas norint sumažinti membranos užsiteršimą, kadangi, pateikus tam tikro stiprumo įtampą, iš membranos yra eliminuojami dalelių depozitai ir atstatoma tėkmė. Vieno tyrimo metu buvo nustatyta, kad geriausia filtracijos tėkmė gali būti pasiekta taikant aukštesnę įtampą, trumpesnius pulsacijos intervalus ir ilgesnės trukmės impulsus. Tačiau, membranoje vykstanti elektrolizė ir dėl to kintantis pH gali sukelti dominančios molekulės inaktyvaciją ir denatūraciją. Aukštos ultragarsinės energijos taikymas skysčiams sukelia akustines sroves ir dėl skysčio įdubimo atsiradusias pjaunančias jėgas, o tai sumažina membranos taršą ir padidina srovės pralaidumą. Taikant aukštesnių dažnių ultragarsą sukeliami didesni akustinių srovių tėkmės greičiai nei taikant žemesnius dažnius esant tam pačiam srovės intensyvumui. Kai kurių tyrimų metu buvo parodyta, kad elektrinis ir ultragarsinis laukai pasižymi sinergistiniais poveikiais, kuomet yra taikomi abu kartu. Vis dėlto, taikant elektrinį lauką, yra sunku modeliuoti užsilaikymo procesą, todėl gali užtrukti, kol ši metodika bus pritaikyta rekombinantinių baltymų gryninimui.

Kita vis sparčiau membranų separacijos procesuose naudojama technologija yra aukšto intensyvumo tangentinės tėkmės filtravimas (angl. high-performance tangential flow filtration; HPTFF). Pav. 4 pavaizduota nukirsto galo filtracijos ir tangentinės tėkmės filtracijos schema. Įprastinės tangentinės filtracijos būdu galima atskirti molekules, kurių dydis skiriasi 10 kartų ar daugiau, tačiau HPTFF metodu galima atskirti molekules, kurių dydis skiriasi iki trijų kartų. Tai padaroma optimizuojant buferius ir skysčių dinamikas bei naudojant membranas su atitinkamais krūviais. HPTFF atveju atsižvelgiama ir į molekulės dydį, ir į krūvį. Šiuo metodu galima atlikti baltymų koncentravimą, gryninimą ir buferio pakeitimą vienos operacijos metu, taip sumažinant apdorojimo proceso kainą. Savo izoelektriniuose taškuose baltymai turi neutralų krūvį ir neturi joninio dangalo, todėl ir pro membranų poras praeina lengviau. Taigi, kruopštus buferio pH, joninės jėgos ir membranos krūvio pasirinkimas yra itin svarbūs, siekiant kad procesas būtų labai selektyvus. Tokiu atveju, dominantis baltymas stipriai užsilaiko, o nešvarumai praeina. HPTFF buvo panaudotas atskiriant baltymų monomerus nuo oligomerų, skirtingus baltymų variantus, besiskiriančius tik viena amino rūgštimi bei Fab fragmentą nuo panašaus dydžio nešvarumų. Visa tai rodo, koks aukštas selektyvumas gali būti pasiektas taikant šį metodą.   

4

Pav. 4. Tangentinės tėkmės (a) ir nukirsto galo (b) filtravimo metodikos.  Pagal Saraswat, 2013.

Alternatyvus membrana grįstas separacijos procesas – membraninė chromatografija. Šio proceso metu naudojama mikrofiltracija arba membranos su didesnio dydžio poromis, kurių vidiniame paviršiuje imobilizuoti ligandai, dėl ko baltymai atskiriami itin selektyviai. Buvo sukurtos jonų mainų, atvirkščios fazės afiniškumo ir hidrofobinių sąveikų membranos. Taip pat membraninės chromatografijos taikymams galima įsigyti lygiasluoksnių, grublėtų ar klostuotų membranų. Membraninė chromatografija gali būti taikoma abiem būdais: tėkmės ir prisijungimo bei eliucijos. Naudojant tėkmės būdą, proceso parametrai yra taip optimizuojami, kad nešvarumai yra prijungiami ir sulaikomi, o dominantis baltymas prateka. Dinaminio prisijungimo gebos ir ekonominiais atžvilgiais membraninė chromatografija itin tinkama didesniems tirpiniams (kaip monokloniniai antikūnai), tačiau prastai tinka mažiems tirpiniams (mažesniems baltymams). Vis dėlto, atitinkamai išvysčius membranos struktūras ir įrenginius, ateityje šie apribojimai turėtų būti apeiti.

Fazių atskyrimas. Iš visų tolimesnių baltymo apdorojimo procesų selektyvaus gryninimo etapas atspindi 70 % visos gamybinės kainos ir didžiąja dalimi yra atliekamas jau minėtais chromatografiniais metodais. Todėl nieko keisto, kad dėl masto didinimo ir didesnių baltymų produktų kiekių šioms sistemoms taikomas ekonominis ir fizinis spaudimai. Tai reiškia, kad tebėra reikalinga įdiegti alternatyvius etapus, kurių metu arba būtų galima gryninti baltymus atskirai, arba atlikti dalinį gryninimą ir taip sumažinti apkrovą tradiciniams gryninimo etapams (pvz., chromatografijai). Viena tokių sistemų yra skysčio-skysčio ekstrakcija, pavyzdžiui, vandeninis dviejų fazių atskyrimas. Vandeninės dviejų fazių sistemos yra suformuojamos sumaišius du struktūriškai besiskiriančių medžiagų vandeninius tirpalus tam tikromis koncentracijomis. Šie du skirtingi komponentai gali būti skirtingi polimerai arba polimeras ir druska (5. Pav.). Tolimesniuose baltymų apdorojimo procesuose produkto fazė susideda iš vandens, o dauguma polimerų pasižymi baltymų struktūrą stabilizuojančiomis savybėmis. Taigi, šios metodikos gerai dera su baltymus produkuojančiomis sistemomis ir teikia privalumų derinant koncentravimo ir gryninimo procesus vieno etapo metu kartu su masto didinimu.

5

 

Pav. 5. Sudedamųjų dalių atskyrimas, panaudojant vandeninį dviejų fazių atskyrimo metodą. Pagal Saraswat, 2013.

Vandeninė dviejų fazių ekstrakcija (angl. aqueous two-phase extraction; APTE) taip pat gali būti naudojama ląstelių, virusinių dalelių ir plazmidinės DNR gryninimui. Taikant bet kurią dviejų fazių sistemą, molekulių atskyrimą įtakoja tokios biomolekulių savybės, kaip hidrofobiškumas, paviršiaus krūvis, dydis ir pačios sistemos sudėtis. Taigi, baltymų atskyrimas vandeninėse dviejų fazių sistemose gali būti valdomas keičiant polimerų masę, pH, joninę jėgą ir fazės komponentų koncentraciją arba tiesiog įdedant afiniškumo ligandų. Tai suteikia lankstumo ir sudaro galimybes sistemos optimizavimui. Taikant šią sistemą, dominantys baltymai atskiriami į vieną fazę, o nešvarumai – į kitą. Atliekant detalius našumo tikrinimus galima nustatyti atskyrimo koeficientą ir skirtingų fazės parametrų poveikį (polimero masės, pH ir joninės jėgos).

Siekiant patikrinti ir optimizuoti biomolekulių atskyrimą ir nustatyti skirtingų parametrų poveikį buvo taip pat panaudoti ir faktorialiniai bei centrinės sudėties konstravimai. Daugiausia buvo naudotos polietileno glikolio (PEG)/dekstrano ir PEG/druskos (pvz., kalio fosfatas) sistemos, bet taip pat tirti ir temperatūrai jautrūs polimerai, kaip etileno oksido-propileno oksido (EOPO) bei pH jautrūs polimerai, kaip polidialilamino etanoatas-dimetilo sulfoksidas (PAEDS). Kuomet dominanti molekulė patalpinama į polimerų fazę, temperatūrai ar pH jautrūs polimerai gali būti precipituojami pakeičiant temperatūrą arba pH, o tuo tarpu dominančios biomolekulės išlieka tirpale. Taikant EOPO sistemą atskiriamo produkto kiekius galima padidinti pridėjus nejoninių detergentų arba prie dominančio baltymo prijungus hidrofobinį žymenį (triptofaną, tiroziną arba hidrofobiną I). Esama nemažai tyrimų apie APTE sistemos panaudojimą monokloninių antikūnų, į insuliną panašaus augimo faktoriaus (IGF), hGH ir insulino ekstrakcijai.

Taip pat gali būti naudojama trijų fazių atskyrimo sistema (angl. three-phase portioning; TPP). Šiuo atveju, viena fazė yra organinio skysčio fazė (pvz., t-butanolis), kita fazė yra druska (pvz., amonio sulfatas), o tarp jų spontaniškai susiformuoja interfazė. TPP yra itin naudinga išskiriant baltymus iš ląstelių ekstraktų, kadangi ląstelinės nuolaužos išsiskiria organinėje fazėje, o nukleorūgštys – interfazėje. Naudojant šį metodą buvo atgaminta daug svarbių biomolekulių, tokių kaip GFP baltymas, ksilanazė bei antigeniniai baltymai. Tai rodo šio metodo paprastumą integruojant jį į gryninimo procesą. Vis dėlto, reikia atsižvelgti į organinio tirpiklio pritaikymą daugybiniams panaudojimams ir sėkmingą jo pašalinimą iš galutinio produkto. APTE tampa pirmaeiliu pasirinkimo metodu biomedikamentinių medžiagų tolimesniam apdorojimui, kadangi jį taikant nesunku padidinti gamybinį mastą, atlikti daugybines operacijas, jis pasižymi biosuderinamumu, nedideliu naudojamų polimerų ir cheminių medžiagų toksiškumu ir proceso integracijos galimybe. Be to, juo galima atlikti švarinimą, koncentravimą ir dalinį gryninimą vieno etapo metu. Tačiau lyginant jį su kitais procesais vien grynumo atžvilgiu jis nėra labai tinkamas. Galimybė integruoti jį į bet kurį ankščiau minėtą pramoninį procesą daro jį tinkamą bet kokiam gryninimo procesui. 

Endotoksinų ir virusų šalinimas. Siekiant panaudoti biologinės kilmės terapines priemones žmonėms, pirmaeilis dalykas yra pašalinti iš jų endotoksinus ir patogenus. Baltymų, skirtų terapiniams tikslams, produkcijai yra labai plačiai naudojamos gram neigiamos bakterijos. Šiuo atveju reikalingi metodai, sumažinantys endotoksinų kiekį iki nustatyto leistino. Ekonomiškų ir efektyvių metodų, skirtų endotoksinų pašalinimui, sukūrimas tebėra rimtas iššūkis biofarmacinei pramonei. Endotoksinai yra itin stabilios molekulės, atlaikančios ekstremalias temperatūras ir pH, todėl sudėtinga juos tiesiog neutralizuoti naudojantis šiurkščiomis sąlygomis, kurios nepažeistų rekombinantinių baltymų aktyvumo. Atsižvelgiant į unikalias endotoksinų molekulines savybes, buvo sukurta daug įvairių metodų, jų pašalinimui: afiniškumo dervos, membranų adsorberiai, jonų mainų ir hidrofobinių sąveikų chromatografija bei dviejų fazių ekstrakcijos ir ultrafiltravimas. Šie metodai skiriasi savo sėkmingumu ir didžioji jų dalis priklauso nuo konkretaus atvejo, t.y., dominančių baltymų savybių. Todėl nėra lengva rasti vieną plačiai naudojamą metodą. Pavyzdžiui, teigiamai įkrauti baltymai, kaip urokinazė, gali būti dekontaminuoti panaudojant anijoninių mainų chromatografiją, kadangi endotoksinai turi bendrą neigiamą krūvį. Tačiau neigiamą krūvį turintys baltymai susidurs su produkto netekimo problema, kadangi jie taip pat prisijungs prie kolonėlės kartu su endotoksinais. Panašiai, maži baltymai gali būti ultrafiltruojami siekiant pašalinti didelius endotoksinų agregatus, tačiau didelių baltymų atveju (pvz., viso ilgio antikūnų) šis metodas nėra tinkamas dėl persidengiančių produkto ir nešvarumų dydžių. Kita didelė problema – endotoksinų sąveika su baltymais, kuri gali įtakoti elgseną tirpale ir, atitinkamai, jų pašalinimui naudojamą metodą. Šalinant LPS iš LPS-baltymų kompleksų galima naudoti alkoholius, nors saugesnės ir nedegios alternatyvos irgi gali būti naudojamos. Pavyzdžiui, alkanedioliu galima pašalinti LPS, kombinuojant jį su jonų mainų chromatografija. Endotoksinų pašalinimui iš baltymų tirpalų taip pat labai dažnai yra naudojamos afininės dervos, kurias sudaro imobilizuotas L-histidinas, poli-L-lizinas, poli(γ-metilo L-glutamatas) arba polimiksinas B. Kitas daug žadantis endotoksinų šalinimo metodas yra vandeninė dviejų fazių micelinė sistema (angl. aqueous two-phase micellar system; ATPMS). ATPMS atveju, esant atitinkamoms tirpalo sąlygoms vandeninis surfaktantas spontaniškai atsiskiria į dvi fazes – micelinę ir nemicelinę. Kruopščiai optimizuojant sąlygas galima atskirti dominantį baltymą vienoje fazėje, o endotoksinus kitoje. Taigi, kaip jau minėta, nėra vienintelio plačiai priimto metodo, skirto endotoksinų pašalinimui.

Virusų šalinimui iš rekombinantinių baltymų naudojamos strategijos apima žemo pH inaktyvaciją, poveikį detergentais, membraninę filtraciją, baltymo-A chromatografiją ir AEX. Vienas svarbus pranašumas taikant baltymo-A arba AEX metodus yra stiprus virusų pašalinimas, išsaugant dervas, kurias galima panaudoti vėl. Naudojant baltymo-A chromatografiją virusai iš antikūnų tirpalų pašalinami leidžiant jiems pratekėti pro kolonėlę. Antikūnai tuo tarpu yra sulaikomi kolonėlėje. AEX atveju, yra prisijungiama DNR, todėl šis metodas geriau tinka virusų pašalinimui. Atliekant virusų filtraciją, membranos užsiteršimas laikui bėgant gali sumažinti virusų valymo efektyvumą, galimai dėl mažėjančio porų dydžio proceso. Virusų šalinimui naujai sukurtos technologijos apima ypatingo dizaino jonų mainų arba su ligandais sujungtas vienkartines membranas. Šiuo atveju aiškus metodo privalumas yra tas, kad galima sukurti labai stipriai besijungiančias membranas, kadangi nėra reikalo, kad prisijungimas būtų grįžtamas. Naudojant šias membranas galima taikyti labai didelius tėkmės greičius ir atitinkamai trumpiau trunkančius procesus.  

Literatūra

[1] Gräslund, S.; Nordlund, P.; Weigelt, J., et al. (2008) Protein production and purification. Nat Methods 5(2): 135–146.
[2] Jayaraj, R.; Smooker, P. M. (2009) So you Need a Protein – A Guide to the Production of Recombinant Proteins. The Open Veterinary Science Journal 3:28-34.
[3] Palomares, L. A.; Estrada-Mondaca, S.; Ramírez O. T. (2004) Production of Recombinant Proteins. Challenges and Solutions. Methods in Molecular Biology 267:15-52.
[4] Saraswat, M.; Musante, L.; Ravidá, A.; Shortt, B.; Byrne, B.; Holthofer, H. (2013) Preparative Purification of Recombinant Proteins: Current Status and Future Trends. BioMed Research International.
[5] Swiech, K.; Picanço-Castro, V.; Covas, D. T. (2012) Human cells: New platform for recombinant therapeutic protein production. Protein Expression and Purification 84:147–153.
[6] Wurm, F. M. (2004) Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nature Biotechnology 22(11):1393-8.

Lecturer