Žmogaus sąnario kremzlė

Free Register

Suaugusio žmogaus sąnario kremzlė yra kraujagyslių neturintis audinys, sudarytas iš specializuoto kolagenų bei proteoglikanų tarpląstelinio užpildo, kuriame glūdi chondrocitai – ląstelinė kremzlės dalis. Manoma, kad chondrocitai nesidalija, tačiau nuolat gamina tarpląstelinį užpildą, lėtai pakeisdami kai kuriuos jo baltymus. Organizmui senstant ar įvairioms ligoms pažeidus sąnarių kremzlę, sutrinka pusiausvyra tarp kolageno bei peptidoglikanų praradimo ir naujai susintetintų molekulių kaupimo tvarkingai organizuotoje struktūroje. Anksčiau manyta, kad kremzlė yra inertiškas audinys, tačiau pastebėtas jos ląstelių gebėjimas reaguoti į kai kuriuos išorinius veiksnius, lemiančius genų raiškos reguliavimą chondrocituose. Įvairūs tyrimai in vitro ir in vivo rodo, kad kremzlės chondrocitai geba reaguoti į mechaninį poveikį kremzlei, biologinius veiksnius, tokius kaip citokinai, augimo ar diferenciacijos veiksniai, lemiantys tarpląstelinio užpildo pokyčius kremzlėje (Goldring ir Marcu, 2009).

Sveika kremzlė: tarpląstelinis užpildas ir chondrocitai

Sveiką žmogaus sąnario kremzlę sudaro apie 15 % kolageno, 15 % peptidoglikanų, 5 % hialurono rūgšties, 60−80 % vandens bei apie 5 % chondrocitų. Tai vienintelės kremzlėje glūdinčios ląstelės, kurios gamina ir organizuoja kolageną, peptidoglikanus bei nekolageninius baltymus į labai specializuotą audinį, atliekantį slydimo bei smūgių slopiklio funkcijas žmogaus organizme. Nors sąnario kremzlės užpildą gamina tik vieno tipo ląstelės, tai nėra vienalytis audinys: užpildo sudėtis bei chondrocitų morfologija kinta nuo kremzlės paviršiaus kaulo link. Šis audinys sudarytas iš keturių morfologinių sluoksnių, dar vadinamų zonomis (Pav. 1):

  • paviršinė zona (PZ) – ploniausias sluoksnis, sudarytas iš elipsės formos ląstelių. Jos sintetina daug kolageno ir mažai peptidoglikanų. Tai daugiausia vandens ir slystantį paviršių turinti zona. Su šia zona susijęs ne tik kremzlės audinio vystymasis, bet ir apozicinis jos augimas. Taip pat žinoma, kad šios zonos ląstelės sintetina įvairių augimo faktorių bei jų receptorių. Tai rodo, kad PZ yra svarbus signalų perdavimo centras kremzlėje (Dowthwaite et al., 2004);
  • pereinamoji zona (PrZ) – sudaryta iš mažesnio (nei paviršinės zonos) kiekio apvalių ląstelių, glūdinčių gausiame tarpląsteliniame užpilde. Kolageno gijos čia išsidėstę netvarkingai, o agrekano kiekis didesnis;
  • viduriniąją zoną (VZ) – sudaro sferos formos ląstelės, išsidėsčiusios eilutėmis, statmenomis kremzlės paviršiui. Kolageno gijos čia storiausios ir gaminama daugiausia peptidoglikanų, tačiau ląstelių tankis – mažiausias;
  • kietoji (kalcifiluotoji) zona (KZ) – sudaryta iš mažo tankio chondrocitų, apsuptų mineralizuoto tarpląstelinio užpildo. Čia ląstelės susitelkia į grupeles, sintetina X tipo kolageną, lemiantį kremzlės atsparumą smūgiams ir palaipsnį perėjimą į kaulą. (Bhosale ir Richardson et al., 2008).

1a1b

A B

Pav. 1. Kremzlės struktūrinės zonos. A: kolageno gijų išsidėstymo schema, B: ląstelių išsidėstymo schema. PZ- paviršinė zona, PrZ- pereinamoji zona, VZ- vidurinioji zona, KZ- kalcifiluotoji zona. Pagal Grogan et al., 2009.

Skirtinga atskirų kremzlės zonose esančio tarpląstelinio užpildo sudėtis ir morfologija kalba apie chondrocitų grupių skirtumus. Kremzlės sluoksniškumas pradeda formuotis iš karto po gimimo, palaipsniui didėjant fiziniam aktyvumui bei slėgimo jėgoms, veikiančioms sąnarį. Cikliškas jų pasikartojimas ne vienodai veikia visus kremzlės sluoksnius. Jis kaskart šiek tiek sutankina tik porėtą PZ užpildą, išstumdamas dalį jame esančio kremzlinio skysčio. Tuo tarpu kitų zonų užpildas ir ląstelės gauna mažesnes apkrovas. Joms sumažėjus, sukuriama hidrostatinė įtampa, dėl kurios išspaustas skystis plūsta atgal į audinį. Mechaninio spaudimo ir skysčio kaita kremzlėje lemia ir pačių ląstelių plokštėjimą bei biocheminės aplinkos pasikeitimą. Ši savo ruožtu keičia užpildo baltymų sintezės bei degradavimo lygius (Wong ir Carter et al., 2003). Vieni iš tokių baltymų – kaulų morfogenezės baltymas (angl. k. BMP: bone morphogenetic protein). Tai augimo veiksnių šeimos atstovai, ypač svarbūs skeleto bei sąnarių formavimuisi. PZ ir KZ chondrocitų in vitro tyrimai rodo, kad BMP raiška kinta skirtinguose kremzlės sluoksniuose. Taip pat tarp zonų skiriasi ir chondrocitų reaktyvumas BMP (Cheng et al., 2007).

Nors kremzlės sudėtis ir struktūra yra pakankamai gerai ištirta, lieka neaišku, kaip šiame audinyje chondrocitai palaiko homeostazę. Žinoma, kad kremzlės ląstelės nesidalina, o tarpląselinis užpildas atskiria jas vieną nuo kitos, trukdydamas ląstelės-ląstelės kontaktą. Chondrocitų nepasiekia kraujotakos sistema: maisto medžiagas jie gauna per gliukozės nešiklius GLUT3 ir GLUT8 bei kitas membraninių nešiklių sistemas. Taip pat kremzlės chondrocitams tenka labai nedaug deguonies: nuo 10 % paviršiuje iki 1 % prie kaulo. In vitro chondrocitai prisitaiko prie mažo deguonies kiekio padidindami HIF-1 α (angl. k. hypoxia – inducible factor-1 alpha) baltymo raišką. Jis lemia GLUT ir VEGF bei kai kurių kitų baltymų, susijusių su chondrocitų diferenciacija bei kremzlės anabolizmu, raišką (Murphy et al., 2009).

Pagrindinė chondrocitų paskirtis kremzlėje yra reaguoti į tiesioginius biomechaninius pokyčius. Jie yra tarsi mechaniniai jutikliai, savo paviršiuje turintys tam tikrų receptorių, kurie sąveikauja su tarpląstelinio užpildo komponentais. Geriausiai ištirti iš jų yra integrinai, reaguojantys į fibronektiną ar II tipo kolageno fragmentus. Šių receptorių aktyvacija gali skatinti uždegiminių citokinų, chemokinų bei tarpląstelinio užpildo peptidazių, daugiausia metalopeptidazių, gamybą. Integrinai reguliuoja ląstelės − tarpląstelinio užpildo signalinius kelius, svarbius augimo ir diferenciacijos valdymui, kremzlės homeostazės palaikymui. Neįprasta integrinų raiška esant sąnarių ligoms gali pakeisti minėtų signalinių kelių eigą bei kai kurių medžiagų sintezės aktyvumą chondrocituose. Taip pat pasikeitimai ląstelėse gali pažeisti pusiausvyrą tarp ardančiųjų (katabolinių) bei reguliacinių veiksnių ir/arba priešuždegiminių (anabolinių) citokinų (Punzi  et al., 2010). 

Pažeista kremzlė: senėjimas

Žmogui senstant, keičiasi biocheminių procesų pobūdis visame organizme, taigi ir kremzlėje. Pastebėta, kad bėgant laikui kremzlės paviršius minkštėja, o tarpląselinis chondrocitų užpildas praranda tamprumą. Šie reiškiniai siejami su sąnario kremzlės tarpląstelinio užpildo struktūros pokyčiais (Goldring ir Goldring, 2007).

Parodyta, kad pagrindinė kremzlės tarpląstelinio užpildo savybių kitimo priežastis yra peptidoglikanų ir kolageno sandaros bei struktūros pokyčiai, lemiantys pakitusią jų išsidėstymo tvarką. Laikui bėgant sumažėja agrekano – gausiausio kremzlės peptidoglikano – molekulinė masė bei kiekis kremzlėje. Manoma, kad tai – sulėtėjusio anabolizmo pasekmė. Taip pat pastebėta, kad kremzlėje kaupiasi AGE (angl. k. advanced glycation end) produktai, didinantys kolageno gijų persipynimo tankį. Šis procesas ženkliai spartina kremzlės standumo didėjimą bei biomechaninių savybių kitimą (Taniguchi et al., 2009).

Senstantiems chondrocitams, kaip ir visoms organizmo ląstelėms, būdingas senėjimo reiškinys – telomerų trumpėjimas, lemiantis dalinimosi lėtėjimą (Goldring ir Marcu, 2009). Tyrimai rodo, kad su senėjimu susijęs ir HMGB2 (angl. k. high-mobility group box) baltymo raiškos visiškas praradimas. Šis nehistoninis chromatino komponentas yra atrankiai sintetinamas kremzlės paviršinio sluoksnio (PZ) ląstelėse ir lemia nuorašos valdymą bei palaiko chondrocitų gyvybingumą. Pradėjus mažėti HMGB2, ima nykti PZ chondrocitai bei jų sintetinamas tarpląselinis užpildas, o tai priskiriama osteoartrito vystymosi pradžiai (Taniguchi et al., 2009).

Viena iš organizmo senėjimo priežasčių laikomas oksidacinis stresas (Finkel ir Holbrook, 2000). Šis, kartu su maisto medžiagų trūkumu, gali sukelti vadinamąjį endoplazminio tinklo (ET) stresą (Yang et al., 2005).. Eukariotinėse ląstelėse ET yra pagrindinė kalcio saugykla, sekrecinių pūslelių, ląstelės membranos ir lizosomų baltymų sintezės bei sulankstymo, prieš jiems patenkant į Goldžio kompleksą, vieta. Būtent endoplazminiame tinkle yra gaminami kremzlės makromolekulių pirmtakai, kurie vėliau modifikuojami ir brandinami Goldžio komplekse, o po to chondrocitų išskiriami į tarpląstelinį užpildą. Tačiau pasireiškus ET stresui, chondrocitai gali nutraukti medžiagų apykaitos procesus ir aktyvuoti naujus, į išgyvenimą sutelktus metabolinius kelius. O tai reiškia laipsnišką užpildo praradimą kremzlėje. Jei ET pažaidos yra pernelyg stiprios, galima chondrocitų apoptozė.

Manoma, kad ET stresas ypač svarbus kremzlės biologijoje. Žinoma, kad jį sukelia tokie veiksniai kaip osmosinis, oksidacinis ar mechaninis stresai, veikiantys chondrocitus. Taip pat svarbus jų jautrumas maisto medžiagų trūkumui dėl kraujagyslių nebuvimo kremzlėje. Sukeltas ET stresas slopina chondrocitų augimą, mažina tarpląstelinio užpildo gamybą tiek informacinės RNR, tiek baltymų raiškos lygmeniu ir galiausiai baigiasi apoptoze (Yang et al., 2005).

Pažeista kremzlė: osteoartritas

Osteoartritas (OA) – tai polietiologinė liga, kurios patologinių procesų pasireiškimas ir progresavimas priklauso nuo daugelio veiksnių. Ji diagnozuojama daugumai vyresnių nei 65 metų amžiaus asmenų. Dažniausios šios ligos pasireiškimo vietos – plaštakos, keliai, klubai, stuburas; simptomai – skausmas, sustingimas, judėjimo apribojimai, uždegimo simptomai. Osteoartritas pažeidžia keletą sąnario komponentų: perichondrinį kaulą, sinovinį dangalą bei kaimyninius, palaikančiosius jungiamojo audinio darinius. Viena iš pagrindinių OA priežasčių laikomas lėtinis kremzlės mikrotraumavimas, sukeliantis laipsnišką sąnario kremzlės praradimą, apozicinį naujo kaulinio audinio ir kaulinių išaugų osteofitų formavimąsi bei subchondrinio kaulo sklerozę. Manoma, kad ligos vystymąsi lemia tokie veiksniai kaip sąnario nestabilumas ir/ar netaisyklinga padėtis, nutukimas, t.y. nenormalios sąnario apkrovos, amžius, su juo susijęs netirpių junginių kristalų kaupimasis sąnaryje, raumenų silpnumas bei periferinė neuropatija (Mutabaruka et al., 2010). 

Jau minėta, kad chondrocitai yra vienintelės kremzlėje glūdinčios ląstelės. Suaugusio žmogaus organizme jos yra visiškai diferencijavusios ir apsuptos tarpląstelinio užpildo. Būtent chondrocitai lemia OA vystymąsi, reaguodami į nepalankius aplinkos dirgiklius: skatindami tarpląstelinio užpildo nykimą bei slopindami kremzlės reparacijos procesus. In vitro bei in vivo tyrimai rodo, kad chondrocitai gamina ir/arba reaguoja į daugelį citokinų bei chemokinų, esančių OA pažeistuose sąnario audiniuose ir skysčiuose. Pakankamai detaliai ištirtas ryšys tarp padidėjusio katabolinių fermentų ir uždegiminių veiksnių, tokių kaip prostaglandinai ar azoto oksidas, kiekio bei interleukino-1β (IL-1β) ir TNF-α (angl.: tumor necrosis factor) koncentracijų OA sąnario sinoviniame skystyje bei audiniuose. Tačiau nors nėra žinomas mechanizmas, paaiškinantis uždegiminių veiksnių gaminimo priežastis, manoma, kad svarbiausi iš jų yra neįprastai didelė sąnario mechaninė apkrova bei oksidacinis stresas (Goldring ir Goldring, 2007). Nenormalios sąnario mechaninės apkrovos skatina peptidoglikanų eikvojimą, ardo kolageno tinklą ir slopina tarpląstelinio užpildo baltymų gamybą. Sąnario traumos atveju skatinama genų raiška, lemianti padidėjusią uždegiminių veiksnių – citokinų bei peptidazių – raišką.

TNF-α ir IL-1β yra svarbiausi ir geriausiai ištirti citokinai osteoartrito patogenezėje. IL-1β, išskiriamas sinovinio audinio arba chondrocitų, skatina pastaruosius gaminti daugelį peptidazių, ardančių kremzlę. Svarbiausios jų yra metalopeptidazės (MMP-1 ir MMP-13), želatinazė (MMP-9) ir stromelizinas (MMP-3), ardančios II tipo kolageną OA kremzlėje; ADAMTS4 ir ADAMTS5 (angl. k. a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs), ardančios agrekaną.

TNF-α ir IL-1β slopina peptidoglikanų bei II tipo kolageno sintezę. Osteoartrito pažeistos kremzlės chondrocitai gamina IL-1β modifikuojantį fermentą (kaspazę – 1) bei I tipo IL-1β receptorių (IL-1RI). IL-1β savo ruožtu geba skatinti MMP, prostaglandino E2 bei azoto oksido (NO) raišką per NO sintetazę (NOS2). IL-1β taip pat skatina kitų uždegiminių citokinų, tokių kaip IL-6, IL-17 ir IL-18, sintezę (Punzi  et al., 2010). Dar IL-1β reguliuoja ciklooksigenazės-2 (COX2), MMP-13 bei NOS2 genų raišką chondrocituose bei kitose ląstelėse, skatindamas tokių nuorašos veiksnių kaip NF-κB (angl. k. nuclear factor-kappa-B), C/EBP (angl. k. CCAAT enhancer-binding protein), AP-1 (angl. k. activator protein 1) ir ETS (angl. k. E26 transformation specific) šeimų narių veiklą, kurie priklauso streso ir uždegimo sukeltam signalinių kelių tinklui (Goldring ir Marcu, 2009).

Nuolat daugėja tyrimų rezultatų, patvirtinančių nenuginčijamą subchondrinio kaulo reikšmę OA vystymesi. Tai siejama su pakitusia jo geba sumažinti patiriamus smūgius, neįprasta osteocitų funkcija, padidėjusia kai kurių kaulinio audinio produktų gamyba, citozinais ir metalopeptidazėmis. Iki šiol neaišku, ar pokyčiai subchondriniame kaule vyksta prieš išsivystant OA, ar po pirmųjų jo atsiradimo reiškinių. Bet kokiu atveju, labai svarbus tampa kraujagyslių, priklausančių kaulų čiulpams, įaugimas į šią sritį, padidėjusios IL-1, TNF ir IL-6 citokinų koncentracijos ir raiška. Tai patvirtina hipotezę, kad krauju aprūpinamos subchondrinės plokštelės gali didinti citokinų bei proteolitinių fermentų sintezę, vadinasi, prisidėti prie kaimyninės hielininės kremzlės ardymo. Minimi destrukciniai pakitimai lemia degeneracinius sąnario pokyčius. Kaip atsakas į kremzlės ardymą, perichondrinėje srityje atsiranda įvairaus dydžio ir formos kaulinės išaugos (osteofitai) padengtos kremzle, o subchondriniame kaule vyksta sklerotiniai procesai.

Angiogenezė ir uždegimas yra artimai susiję procesai OA vystymesi ir gali lemti ligos progresavimą bei skausmą. Atsiradusi kraujo apytaka skatina chondrocitų hipertrofiją ir endochondrinį kaulėjimą. Tuo tarpu kilęs uždegimas įjautrina nervus, taip sukeldamas skausmą. Sąnario kremzlės inervacija gali vykti kartu su vaskuliarizacija, o spaudimo jėgos ir hipoksinės sąlygos stimuliuoti naujuosius nervus (Punzi et al., 2010).

Osteoartrito gydymo būdai

Chirurgija

Žmogaus sąnario kremzlės pažeidimų bei OA gydymas − sudėtingas iššūkis šiuolaikinei medicinai dėl kremzlės riboto gebėjimo savaime atsistatyti. Efektyvių terapinių būdų vystymas vis dar yra procesas ir šiuo metu dauguma rekomenduojamų vaistų tebėra orientuoti į simptomų palengvinimą, bet ne ligos eigos keitimą. Todėl dažniausiai sąnario keitimo operacija siūloma kaip geriausias būdas sąnario funkcijai atstatyti.

Be sąnario keitimo operacijos, taip pat taikoma nemažai alternatyvių chirurginių metodų, leidžiančių išvengti sąnario praradimo. Pavyzdžiui, atliekant abrazyvinę artroplastiką, subchondrinis kaulas perforuojamas gręžiant ir sukeliamas kraujavimas į pažeidimo vietą. Susiformavęs krešulys sukuria tinkamą aplinką, skatinančią kaulų čiulpų mezenchimines kamienines ląsteles migruoti į pažaidos vietą, ten proliferuoti, bei diferencijuoti chondrogenine kryptimi. Kraujavimas į pažeidimo vietą taip pat sukeliamas ir mikrolūžių (angl. k. microfracture) metodu, kuomet subchondrinis kaulas yra gremžiamas. Tačiau šių metodų taikymo rezultatai nėra nuspėjami: su krauju suplūdusios ląstelės formuoja skaidulinį kremzlinį audinį, kuris laikui bėgant sunyksta.

Kitas chirurginis būdas atstatyti pažeistą kremzlę remiasi kremzlės alograftų perkėlimu į pažeidimo vietą. Šiam metodui įgyvendinti reikalingas osteochondrinių fragmentų donoras. Tai apsunkina procedūrą, nes pacientui reikia laukti tinkamo audinio donoro. Be to yra galimybė užsikrėsti įvairiomis ligomis. Tačiau naudojamas ir alternatyvus šio metodo variantas – mozaikinė artroplastika (2 pav.). Jos metu osteochondrinio audinio gabaliukai paimami iš paties paciento sąnario vietų, kurios nepatiria didelių apkrovų. Šie kremzlės gabaliukai įstumiami į pažeidimo vietą užpildant be kremzlės likusią ertmę. 

2

21

Pav. 2. Mozaikinės artroplastikos procedūra. (Hangody L, et al: 2004)

Kairėje: pašalinama pažeista kremzlė. 

Centre: praduriamos skylutės subchondriniam kaule. 

Dešinėje: Atsikuria naujos sveikos kremzlės ląstelės ir atkuriamas audinys.

Ląstelių terapija

Nors vis dar taikomi tiek mikrolūžių, tiek alograftų chirurginiai metodai kremzlės pažaidoms gydyti, tačiau vis daugiau tikimasi iš audinių inžinerijos mokslo, kurio pagrindinis tikslas − kremzlės regeneracija panaudojant ląstelių terapiją. Jos esmė – autologinių chondrocitų ar kitų chondrogeniškų ląstelių padauginimas in vitro ir implantavimas pacientui tikintis, kad jos suformuos funkcionalų kremzlinį audinį pažaidos vietoje. Taigi šiuo metu vykstantys intensyvūs tyrimai sutelkti metodų tobulinimui trimis pagrindinėmis audinių inžinerijos kryptimis: tinkamų ląstelių paieška, optimalių kultivavimo sąlygų parinkimas, biologinių ląstelių nešiklių – karkasų kūrimas (Chiang ir Jiang, 2009).

Kamieninės ląstelės kremzlės regeneracijai 

Atrastos kaulų čiulpuose mezenchiminės kamieninės ląstelės (MKL) yra išsamiai charakterizuotos in vitro. Jos geba atsinaujinti ir diferencijuoti į mezodermos ląstelių linijas, vadinasi, formuoti kremzlę, kaulinį ir riebalinį audinį, raiščius ir sausgysles, griaučių raumenis bei jungiamojo audinio stromą. Dėl šios priežasties susidomėta jų pritaikymu kremzlės pažaidų gydyme.

Yra keletas pagrindinių reikalavimų MKL norint jas pritaikyti kremzlės regeneracijai. Pirmiausia, ląstelės turi būti efektyviai pristatomos į pažaidos vietą, t.y. gebėti migruoti  jos link. Antra, MKL turi gebėti prisitvirtinti prie supančio užpildo bei daugintis ir taip aprūpinti pažaidą reikiamu kiekiu chondrocitų ląstelėmis-pirmtakėmis. Trečia, reikia, kad MKL pasidauginę pradėtų diferencijuotis į chondrocitus ir gamintų tarpląstelinį užpildą. Taip pat tvirtai kremzlei atstatyti naujai susiformavęs audinys turi prisitaikyti prie mechaninių apkrovų ir susikurti homeostazę.

Tyrimai in vitro rodo, kad MKL puikiai atitinka minėtus joms keliamus reikalavimus: jos migruoja link tokių chemoatraktantų kaip PDGF ar EGF, proliferuoja ir diferencijuoja chondrogenine kryptimi. Taip pat MKL tam tikromis sąlygomis geba gaminti II tipo kolagenu ir peptidoglikanais praturtintą užpildą. Tačiau in vivo tyrimuose susiduriama su sunkumais MKL diferenciacijos etape. Perkeltos į pažaidos vietą, chondrogenine kryptimi diferencijavusios MKL patiria hipertrofiją ir galutinę diferenciaciją kaip ir augimo plokštelėje, t.y. vyksta ląstelių kalcifikacija in vivo. Tuo tarpu nesimineralizuojančios MKL praranda gebėjimą kaupti II tipo kolageną ar jų pagamintas užpildas yra suardomas. Šie rezultatai rodo, kad be tinkamo MKL diferenciacijos skatinimo ypač svarbu atrasti būdus, kaip sulaikyti šių ląstelių diferenciaciją norimame etape, o tai – didelis iššūkis norint sėkmingai klinikoje pritaikyti MKL transplantacija paremtus kremzlės inžinerijos metodus (Dickhut et al., 2008).

Autologiniai chondrocitai kremzlės regeneracijai

Kremzlės regeneracija autologinių chondrocitų įsodinimu (ACI: angl. k. autologous chondrocyte implantation), pirmą kartą pritaikyta ir aprašyta 1994 metais, kaip alternatyvus OA gydymo būdas didesnio ploto (>2,5cm2), viso storio kremzlės pažeidimams atstatyti (Brittberg et al., 1994). Jo metu paimama biopsija iš nepažeistos paciento kremzlės vietos, fermentiniais metodais išskiriamos ląstelės, padauginamos vienasluoksnėje kultūroje in vitro ir vėl sušvirkščiamos pacientui į pažeistą vietą (Brittberg 1994). Pirmos kartos ACI metu pažeistas plotas užlipdomas autologiniu periosto lopiniu (angl. k. periosteal patch) ir po juo sušvirkščiama padaugintų chondrocitų suspensija. Tyrimais patvirtinta, kad šiuo metodu pavyksta pasiekti simptomų sumažėjimo ir hialininės kremzlės formavimosi. Vėliau ši metodika tobulinta dėl didelių kaštų bei pernelyg sudėtingų operacinių procedūrų. Pastebėta, kad periosto lopinys lemia susiformavusio kremzlinio darinio kaulėjimą, todėl pristatyta antros kartos ACI, kurios principas išlieka tas pats kaip ir anksčiau taikytos, tačiau vietoj periosto kaip žaizdos dangalas naudojama kolageno membrana ir gaunama mažiau komplikacijos atvejų;  šis antrosios kartos ACI variantas yra vadinamas užpildo indukuota autologinių chondrocitų implantacija (MACI: angl. k matrix-associated autologous chondrocyte implantation). Jis pasižymi tuo, kad padauginti chondrocitai užsėjami ant I/III tipo kolagenų membranos, pagamintos iš kiaulės pilvaplėvės. Šia membrana vėliau užklijuojama OA pažeista kremzlės vieta (Brittberg, 2010).

Trečios kartos ACI naudoja chondrocitus, įterptus į trimačius užpildus. Chondrocitų kultivavimas trimačiuose alginato, kolageno geliuose, hialurono rūgšties užpilduose ar kai kurių sintetinių polimerų struktūrose palaiko jiems būdingą chondrogeninį fenotipą ir skatina gaminti kremzlės tarpląstelinį užpildą. Apskrita ląstelių forma per aktino depolimerizaciją indukuoja Sox9 transkripciją ir tuo skatina dediferencijuotų chondrocitų rediferenciaciją (Kumar 2009). Ketvirtos kartos ACI daug sudėtingesnės – jos panaudoja skirtingas deguonies koncentracijas, mechaninį spaudimą, karkasų fizines-chemines savybes ir chondrogeninę diferenciaciją skatinančias medžiagas. Siekiama surasti tinkamiausią visų įtakojančių medžiagų derinį, kuris palaikytų chondracitams būdingą fenotipą, o ypač – II tipo kolageno gamybą ir tuo pačiu hialininės kremzlės atkūrimą, ir blokuotų I tipo kolageno gamybą bei fibrokremzlės vystymąsi, – tai šiuo metu kelia didžiausią problemą (Gavénis et al. 2006, Demoor et al. 2012).

Chondrocitų padauginimas in vitro kremzlės regeneracijai

Vienas pirmųjų minėtų ACI metodų etapų yra riboto kiekio chondrocitų populiacijos išskyrimas iš kremzlės, gautos biopsijos metu, bei jų padauginimas in vitro. Šiuo metu efektyviausias žinomas chondrocitų padauginimo būdas in vitro yra jų auginimas vienasluoksnėje kultūroje. Jis pasirenkamas dėl kremzlės ląstelių gebėjimo žymiai efektyviau daugintis tokiomis sąlygomis nei trimatėje kultūroje. Tačiau auginant žmogaus sąnario kremzlės chondrocitus vienasluoksnėje kultūroje, keičiasi jų fenotipas ir genų raiška. Manoma, kad ji prasideda įvairiomis peptidazėmis išlaisvinus chondrocitus iš tarpląstelinio užpildo ir jiems prisitvirtinus prie plastikinio kultivavimo indo paviršiaus. Tuomet chondrocitai pakartotinai grįžta į ląstelės ciklą, dalijasi ir virsta panašiomis į fibroblastus ląstelėmis (Diaz-Romero et al., 2005).

Nors klinikiniai tyrimai su gyvūnais yra gana sėkmingi (Mainil-Varlet et al. 2001; Li et al. 2008), žmogaus atveju susiduriama su tam tikrais sunkumais. Pagrindinis jų – kremzlės ląstelių chondrogeninių galimybių kaita, priklausanti nuo daugelio veiksnių, tokių kaip biopsijos vieta, kultivavimo terpės priedai, kultivavimo trukmė. Taip pat parodyta, kad skirtumų atsiranda ir tarp vienos biopsijos skirtingų ląstelių populiacijų. Žymenų, leidžiančių numatyti ląstelių chondrogenines galimybes, nustatymas padėtų atskirti chondrocitų, padaugintų in vitro, porūšį ir taip praturtinti turimą chondrocitų populiaciją labiau linkusiomis formuoti kremzlę ląstelėmis (Grogan et al., 2007).

Chondrocitų fenotipo kaita in vitro kultūroje

Nuo to momento, kai ląstelės yra išskiriamos iš kremzlės ir pradeda tvirtintis prie kultivavimo indo paviršiaus bei dalytis, keičiasi jų genų raiška ir palaipsniui prarandamas chondrocitų fenotipas. Tai siejama su ląstelių morfologijos pokyčiais, būtent – apvalios formos netekimu bei sumažėjusia tarpląstelinio užpildo komponentų gamyba.  Dauginant chondrocitus vienasluoksnėje kultūroje jie nustoja sintetinti kremzlės tarpląsteliniam užpildui būdingus komponentus: II bei IX tipo kolageną, peptidoglikanus bei agrekaną. Taip pat sumažėja kremzlės paviršinės zonos (PZ) sintetinamo baltymo lubricino, sutepančio sąnario paviršių, sintezė bei chondromodulino, chondroadherino ir pagrindinio chondrogenezei būdingo nuorašos veiksnio SOX9 sintezė. Tačiau chondrocitai pradeda gaminti versikaną, fibronektiną ir I, III bei IV tipų kolageną, būdingus fibroblastams ir jungiamajam audiniui. (Tew et al. 2008, Schulze-Tanzil 2009).

Chondrocitų fenotipo kaita kultivuojant vienasluoksnėje arba trimatėje (3D) kultūroje vadinama, atitinkamai, dediferenciacija bei rediferenciacija. Jų metu keičiasi ląstelių genų raiška. Manoma, kad šiuos pokyčius lemia chondrocitų išlaisvinimas iš tarpląstelinio užpildo, tai visiškai pakeičia ląstelių gaunamus signalus iš aplinkos ir skatina tokius procesus kaip ląstelių dalijimasis, kuris normaliai yra slopinamas ląstelėms glūdint kremzlėje. (Hardingham et al., 2006). Kadangi chondrocitų dauginimas vienasluoksnėje kultūroje lemia laipsnišką jų dediferenciaciją, pagrindinis šiuo metu atliekamų tyrimų tikslas yra atrasti būdą, kaip efektyviau palaikyti šių ląstelių chondrogeninį potencialą. Dažniausiai naudojami metodai, pagrįsti mimikrijos principu: ląstelės kultivuojamos panašiomis į natūralias sąlygas. Būtent dėl šios priežasties dažnai naudojama trimatė kultūra bei įvairūs augimo veiksniai. 

Trimatė kultūra bendru atveju yra palanki ląstelių apvalėjimui, nes ląstelės neturi galimybės prisitvirtinti prie kultivavimo indo paviršiaus. Taip pat atsiradę stipresni ląstelė-ląstelė ir ląstelė-tarpląstelinis užpildas kontaktai, tokie kaip plyšinės jungtys, lemia chondrocitų rediferenciaciją. (Schulze-Tanzil 2009). Ląstelėms rediferencijuoti naudojamos įvairios medžiagos: agarozės, kolageno, fibrino geliai, alginatas, skaiduliniai polihidroksirūgščių karkasai bei hialurono rūgšties karkasai (Grogan et al., 2003). Pirmiausia ląstelės, išskirtos iš sąnario kremzlės dauginamos vienasluoksnėje kultūroje, o vėliau perkeliamos į trimatę. Parodyta, kad perkėlimas ir kultivavimas alginato sferose ar suspensijose ant 2-polihidroksietilmetakrilatu (poly-HEMA) dengtų indų gali lemti de novo II tipo kolageno bei SOX9 sintezę. (Tew et al., 2008). 

Vis dėlto laikui bėgant chondrocitai, dauginami vienasluoksnėje kultūroje, praranda gebėjimą rediferencijuoti. Tai nutinka maždaug po septynių populiacijos padvigubėjimų. Ši ląstelių savybė riboja chondrocitų dauginimą in vitro ir gaunami kiekiai gali būti nepakankami ląstelių terapijai. Taigi papildomai į kultivavimo terpę dedama augimo veiksnių, tokių kaip TGFβ1, FGF-2 ar PDGF-BB, kurie didina jų chondrogeniškumą. Šio tyrimo rezultatai parodė, kad augimo veiksniais veiktos dauginamos ląstelės formuoja ląstelių sferas, kurių pjūviai žymiai intensyviau dažosi safraninu-o (specifiškai dažančiu kremzlės tarpląstelinį užpildą) bei kaupia 2,4 karto daugiau gliukozaminoglikanų (GAG) nei augimo faktoriais neveiktos.

Žinoma, kad TGFβ šeimos nariai (TGFβ1, 2, 3) skatina tarpląstelinio užpildo gamybą sąnario kremzlės chondrocituose. IGF-1 taip pat skatina tarpląstelinio užpildo gamybą bandymuose atstatyti kremzlės pažeidimus in vivo. In vitro IGF-1 kartu su TGFβ-1 skatina agrekano ir II tipo kolageno genų raišką. FGF-2 daugelio ląstelių atveju yra potencialus mitogenas, mažomis koncentracijomis skatinantis kolageno ir GAG gamybą in vitro. Tačiau didesnės FGF-2 koncentracijos slopina chondrocitų chondrogeniškumą (Tew et al., 2008). 

Nors ir panašu, kad žmogaus sąnario kremzlės chondrocitų dauginimo ir rediferenciacijos tyrimų rezultatai yra daug žadantys tobulinant pažeistos sąnario kremzlės atstatymo metodus, vis dar trūksta supratimo, kokie molekuliniai mechanizmai lemia išskirtų chondrocitų dediferenciaciją bei galimybes rediferencijuoti. Todėl labai svarbu nustatyti skirtumus tarp įvairių ląstelės diferenciacijos etapų. Tuo tikslu pasiūlyti keli molekuliniai žymenys: COMP (angl. k cartilage oligomeric matrix protein) ir IX tipo kolagenas nurodyti kaip ankstyvieji chondrocitų dediferenciacijos žymenys kremzlėje, kurie nustojami sintetinti greičiau nei pagrindinis tarpląstelinio užpildo komponentas II tipo kolagenas. (Schulze-Tanzil 2009). Taip pat dažnai naudojamas II ir I tipų kolageno (COL2/COL1) ar agrekano-versikano (AGG/VER) santykis kaip ląstelių dediferenciacijos rodiklis, siekiant apibūdinti kultivuojamus chondrocitus (Diaz- Romero et al., 2008). 

Paviršiaus žymenys chondrocitų charakterizavimui

Kaip alternatyva kremzlės ląstelių chondrogeniškumui įvertinti buvo pasiūlytas chondrocitų paviršiaus žymenų kaitos vertinimas vienasluoksnėje kultūroje tėkmės citometrijos metodu. Jis pristatomas kaip papildomas būdas įvertinti ląstelių diferenciacijos etapą, nustatant paviršiaus žymenis, esančius ant ląstelių, o ne jų sintetinamus tarpląstelinio užpildo komponentus. Taip pat konkrečių paviršiaus žymenų, būdingų chondrocitams, tam tikru dediferenciacijos momentu aptikimas, leistų išskirstyti šias ląsteles pagal žymenų derinius. Manoma, kad taip būtų galima praturtinti išskirtą ląstelių populiaciją didesnį chondrogeniškumą turinčiomis ląstelėmis. 

Vieną išsamiausių bandymų nustatyti detalų žmogaus sąnario kremzlės chondrocitų paviršiaus žymenų fenotipą atliko Diaz-Romero ir kolegos (Diaz-Romero et al., 2005). Jų rezultatai parodė, kad ant chondrocitų aptinkami tokie paviršiaus žymenys: integrinai (α1 arba CD49a, α3 – CD49c, α5 – CD49e, α6 – CD49f, αV – CD51, β1 – CD29), adhezijos molekulės (CD54, CD106, CD166, CD44), tetraspaninai (CD9, CD63, CD81, CD151) bei kiti paviršiaus žymenys (CD90, CD99, CD105 ir kt.).

Tetraspaninai yra hidrofobiniai baltymai, turintys keturis transmembraninius domenus ir dvi tarpląstelines kilpas. Jie sąveikauja su skirtingų rūšių baltymais, tokiais kaip integrinai, membranų receptoriai bei viduląstelinės signalinės molekulės. Kai kuriuos tetraspaninus (CD9 ar CD81) gamino beveik visos tirtos ląstelės. Taip pat šios molekulės tiesiogiai arba netiesiogiai turi įtakos viduląstelinių signalų perdavimui. Vienas iš atsakų į tokį tetraspaninų perduodamą signalą – kalcio kaupimas ląstelėje, kurį perduoda CD9 ir CD81. Taip pat CD151 sąveikauja su fosfatidilinozitolio-4 kinaze (PI4K) kaip jungtukas tarp sąveikaujančio integrino ir PI4K molekulės. (Yunta ir Lazo, 2003). Parodyta, kad būtent CD81 ir CD151 yra vis labiau sintetinami kultivuojant chondrocitus vienasluoksnėje kultūroje. CD151 savitai jungiasi prie lamininus prijungiančių integrinų, tokių kaip α3β1 ir α6β1, kurie taip pat yra vis labiau sintetinami. Visgi nepaisant integrinų ir tetraspaninų sąveikos, jie neveikia nuo integrinų priklausomos ląstelių adhezijos, bet greičiau susiję su ląstelių migracija, susiliejimu bei signalų perdavimu. (Diaz-Romero et al., 2005).

Integrinai yra heterodimeriniai glikoproteinai, sudaryti iš α ir β subvienetų iš kurių kiekvienas turi tarpląstelinį bei citoplazminį domenus. Tarpląsteliniai domenai jungiasi su daugybe tarpląstelinio užpildo baltymų, tarp kurių ir II bei VI tipų kolagenas bei fibronektinas. Integrinų šeimos atstovai yra pagrindinės molekulės-tarpininkės tarp ląstelių ir tarpląstelinio užpildo, siejamos su struktūriniais bei funkciniais supančių audinių pokyčiais, tokiais kaip adhezija bei diferenciacija. (Goesler et al., 2006). Parodyta, kad vienasluoksnėje kultūroje dauginamiems chondrocitams būdinga padidėjusi integrinų CD49c, CD49e, CD49f, CD51, adhezijos molekulių CD166, CD44 gamyba (Diaz Romero et al., 2005). Šie duomenys paremia jau anksčiau iškeltą hipotezę, kad žmogaus sąnario chondrocitų fenotipas keičiasi dėl ląstelių aplinkos pasikeitimų ar adhezijos prie plastiko.

Be tetraspaninų bei integrinų aptiktos kelios kitos molekulės, kurias savo paviršiuje pateikia kultivuojami chondrocitai: CD105 (endoglinas, TGFβ receptoriaus komplekso dalis), CD10 (endopeptidazė), CD90 (Thy-1) ir CD73 (5‘-nukleotidazė) (Diaz-Romero et al., 2005). Šios molekulės kartu su CD166 (ALCAM: angl.k. activated leukocyte cell adhesion molecule) žinomos kaip pagrindiniai žmogaus mezenchiminių kamieninių ląstelių žymenys. Taigi manoma, kad chondrocitai, bent jau paviršiaus žymenų kontekste, kultivuojami vienasluoksnėje kultūroje tampa panašūs į MKL (Diaz-Romero et al., 2008). Vis dėlto nesutariama, ar MKL žymenų pateikimas chondrocitų paviršiuje yra dediferenciacijos pasekmė, ar kremzlėje glūdi mažas kiekis chondrocitų ląstelių pirmtakių, kurios pasidaugina vienasluoksnėje kultūroje. Šiam faktui patikrinti atlikti lyginamieji paviršiaus žymenų tyrimai ant vienasluoksnėje kultūroje augintų chondrocitų ir kaulų čiulpų MKL. Rezultatai parodė, kad paviršiaus žymenų pateikimas mažai kito ant MKL ir daugumos žymenų atveju didėjo ant chondrocitų. Taip pat nustatytas paviršiaus žymenų derinys, pagal kurį skyrėsi kultivuotos MKL ir chondrocitai: CD14/CD90/CD105. Kultivuoti chondrocitai pateikė savo paviršiuje CD14, kurio raiška koreliuoja su chondrocitų gebėjimu sintetinti II tipo kolageną, o MKL – nepateikė. Taip pat abi ląstelių rūšys pateikė CD90 ir CD105, bet chondrocitai intensyviau ekspresavo CD90, o MKL – CD105 (Diaz-Romero et al. 2008). 

Parodyta, kad chondrocitų gebėjimas rediferencijuoti priklauso nuo daugelio veiksnių, tokių kaip biopsijos vieta, kultivavimo terpės priedai, kultivavimo laikas. Todėl manoma, kad savitų žymenų, kurie leistų prognozuoti ląstelių chondrogeniškumą, aptikimas leistų ne tik įvardinti kultivuojamų chondrocitų kokybę, bet ir atskirti jų subpopuliacijas, labiau pasižyminčias gebėjimu rediferencijuoti. Taip galima būtų pagerinti būsimo audinio, kurį formuos chondrocitai, savybes. (Grogan et al., 2007) Šiam tikslui bandyta atrinkti chondrocitų subpopuliacijas pagal CD90 – dar vieną MKL būdingą žymenį. Šio tyrimo rezultatai parodė, kad CD90 negali būti naudojamas kaip chondrogeniškumo žymuo, nes atrinktų ląstelių chondrogeniškumas buvo atvirkščiai proporcingas nuo CD90 raiškos ląstelių paviršiuje (Giovannini et al., 2009). Taigi kol kas vis dar nėra aptikta paviršiaus žymenų derinio, kurio pagalba galima būtų atrinkti ilgiau chondrogeniškumą išlaikančias kremzlės ląsteles. Tam reikia papildomų tyrimų su daugiau paviršiaus žymenų ir jų derinių.

Įvairios kilmės ląstelių mišrus kultivavimas (ko-kultūros)

Mišrus kultivavimas (MK) leidžia skirtingų tipų ląstelėms parakriniškai veikti vienoms kitas, išskiriant įvairius biologinius junginius. MK gali būti tiesioginis, kai skirtingos ląstelės gali betarpiškai kontaktuoti viena su kita ir netiesioginis, kai ląstelės yra atskirtos porėtos membranos, leidžiančios praeiti tirpioms medžiagoms, bet neleidžiančios ląstelėms susiliesti.

Šio tipo MK dažniausiai naudojami ląstelių diferenciacijos eksperimentuose. Dediferencijuotų chondrocitų MK su sveikais chondrocitais buvo atliekamas tam, kad išsiaiškinti ar diferencijuotų chondrocitų gaminami anaboliniai faktoriai padeda dediferencijuotiems chondrocitams rediferencijuotis. Tyrimai parodė, kad dediferencijuoti chondrocitai pradėjo gaminti daugiau peptidoglikanų ir kolagenų, tačiau kartu su II tipo kolageno gamyba padidėjo ir nepageidaujama I tipo kolageno gamyba (Gan L., Kandel 2007). 

Šiuo metu dažniausiai tiriamos chondrocitų ir MKL MK, nes tikimasi, kad gaudamos signalus iš subrendusių chondrocitų, MKL galėtų sėkmingai diferencijuoti ir išlaikyti reikalingą diferencijuotą būklę, tuo pačiu išspręsdamos reikalingo didelio ląstelių kiekio problemą, nes gauti ir padauginti MKL yra žymiai paprasčiau, nei chondrocitus. Buvo atliekami ir žmogaus MKL tiesioginiai MK su jaučio chondrocitais, terpę papildant chondrogeninės diferencijacijos veiksniais deksamethazonu bei TGF-β3. Ši sąveika per 1-4 savaites padidino žmogaus II tipo kolageno ir tarpląstelinio užpildo gamybą ir paskatino ląstelių proliferaciją (Tsuchiya et al. 2004). 

Buvo atlikti panašūs eksperimentai ir su žmogaus chondrocitais, kultivuojamais kartu su MKL trimatėje struktūroje (ląstelės, sukoncentruotos centrifugavimu) ir veikiant (arba neveikiant) u bei TGF-β1. Be šių diferenciacijos veiksnių chondrocitai pasižymėjo S100 baltymų, II tipo kolageno ir peptidoglikanų raiška, bet MKL – ne. Tam kad ir MKL padidėtų tarpląstelinio užpildo komponentų genų raiška, TGF-β1 ir deksamethazono poveikis buvo būtinas. Deja, šis MK paskatino ir chondrocitų hipertrofiją, padidindamas X tipo kolageno raišką bei kremzlės mineralizaciją, skatindamas šarminės fosfatazės aktyvumą (Giovannini et al. 2010). Išsamesni tyrimai parodė, kad stebimi pokyčiai tokioje MK yra greičiau MKL išskiriamų biologiškai aktyvių veiksnių skatinamasis/maitinamasis poveikis chondrocitams, nei tendencija MKL diferencijuoti į chondrocitus (Wu et al. 2012).

Pastaruoju metu itin išpopuliarėjus indukuotų pliuripotentinių kamieninių ląstelių (iPKL) eksperimentams, šių ląstelių MK su chondrocitais taip pat buvo tiriamas. Chondrocitai, kultivuojami alginato matricoje kartu su iPKL, sukurtomis iš osteoartritinių chondrocitų ir papildomai transfekuotomis TGF-β1 genu, padidino kremzlės žymenų, tokių kaip II tipo kolagenas, agrekanas ir COMP, raišką (Wei et al. 2012). iPKL yra perspektyvus ląstelių šaltinis regeneracinės medicinos vystymui, tačiau šių ląstelių kūrimui genų nešėjais šiuo metu yra naudojami įvairūs virusai, todėl jos kol kas negali būti taikomos klinikiniuose tyrimuose.

Karkasai kremzlės inžinerijai ir kita ląstelių auginimo aplinka

Labai svarbus atstatomos kremzlės komponentas yra įvairūs karkasai, pagaminti tiek iš natūralių, tiek iš naujai susintetintų medžiagų. Į šiuos karkasus dažniausiai įauginamos in vitro padaugintos ląstelės, tiek chondrocitai, tiek MKL, o tada toks darinys jau įsodinamas į pažeistą kremzlės vietą. Kartais karkasai be ląstelių naudojami kaip pagrindas pritraukti kaulų čiulpų MKL iš osteochondrinių defektų vietų ir taip aktyvuoti natūralų subchondrinio kaulo atkūrimo procesą. Bet kokiu atveju fizinės ir cheminės karkasų savybės įtakoja naujai sintetinamos kremzlės kokybę. Karkasai privalo pasižymėti:

  1. biologiniu suderinamumu, leidžiančiu implantui pilnai integruotis į jį supantį audinį ir iki minimumo sumažinti galimas organizmo imunines reakcijas;
  2.  galimybe pilnai suirti – laipsniška, aplinkos kontroliuojama karkaso rezorbcija turi vykti kartu su natūralaus kremzlės audinio sinteze;
  3. akyta struktūra, leidžiančia viduje judėti tiek įsodintoms, tiek iš gretimo audinio pritrauktoms ląstelėms bei difunduoti mitybinėms bei šalinamoms medžiagoms ar dujoms;
  4. tinkamos ląstelių prikibimui ir chondrogeninės struktūros indukcijai ir/arba palaikymui bei reikalingų bioaktyvių molekulių pernašai;
  5. tvirtumu, elastingumu ir kitomis mechaninėmis savybėmis, leidžiančiomis atlaikyti spaudimą, deformacijas ir kitus fizinius krūvius, neprarandant audinio tūrio. 

Taip pat labai svarbu įvertinti karkasų kainą, gaminimo procesą ir galimybę lengvai ir saugiai įsodinti į pažeistą audinį. Kremzlės inžinerijai buvo pasiūlyta ir išbandyta daugybė natūralių ir sintetinių biopolimerų – kempinių, hidrogelių, skaidulų, tinklelių ir mikrodalelių (Puppi et al. 2010). Mikro ir nanodalelės buvo pritaikytos pernešti įvairius augimo faktorius ir kitas biologiškai aktyvias medžiagas, galinčias pagerinti kremzlės regeneraciją.

Natūralių medžiagų karkasai

Natūralios medžiagos yra kuriamos iš baltymų, tokių kaip kolagenai, šilko fibroinas, želatina; polisacharidų – chitozano, hialurono rūgšties (HR), alginato, modifikuoto krakmolo, celiuliozės, dekstranų, agarozės; mikrobinės kilmės poliesterių – polihidroksialkinoatų (PHA), polihidroksibutiratų (PHB) (Puppi et al. 2010). Šie karkasai yra bioaktyvūs, nes kilę iš įvairių biologinių struktūrų – audinių arba tarpląstelinių užpildų, tinkamų prikibti ląstelėms ir teikiančių jų augimui bei brendimui reikalingus signalus. Taip pat šios medžiagos kaip natūrali gyvų organizmų dalis yra suderinama su aplinka ir lengvai suardoma bei rezorbuojama, nors per greitas karkaso suirimas, dar nesusiformavus natūraliam kremzlės tarpląsteliniam užpildui, gali pažeisti atstatomo audinio struktūrą. Be to, biogeliai yra biomechaniškai gana silpni ir sąnariui judant sunkiai atlaiko krūvį. Iš kolageno ar hialurono rūgšties pagaminti karkasai šiuo metu naudojami dažniausiai, nes tai yra natūralios kremzlės medžiagos.

Trimačiai kolageno karkasai gali būti kempinių, gelių ir membranų pavidalo. Jie paprastai gaminami iš atelokolageno, kad  būtų pašalintos antigeninės determinantės, taip išvengiant imuninių reakcijų. Dažniausiai naudojamas I tipo kolagenas, o taip pat dvisluoksniai I ir III tipo kolagenų membranų ar kempinėlių dariniai, kurie skatina chondrocitų rediferenciaciją. Vien iš II tipo kolageno pagamintos kempinėlės gali išsaugoti diferencijuotų chondrocitų būklę, kultivuojant juos 3 savaites, bet negali sukelti dediferencijuotų chondrocitų rediferencijacijos, todėl jie su laiku tampa hipertrofiniais (Freyria et al. 2009). 

Plačiai taikomi ir iš polisacharidų pagaminti karkasai. Tokių sėkmingų eksperimentų pavyzdžiais galėtų būti triušių chondrocitų, augintų agarozės gelyje, alogeninis įsodinimas, kuris po 18 mėnesių histologiniuose pjūviuose parodė gausią naują II tipo kolageno ir gliukozaminoglikanų (GAG) sintezę; panašūs rezultatai buvo gauti su dediferencijuotais jaučio chondrocitais, kurie alginato gelyje sėkmingai rediferencijavo; taip pat gera rediferenciacija buvo gauta ir su chitosano karkasais (Rahfoth et al. 1998, Domm et al. 2002, Lee et al. 2007). Taip pat agarozės ir alginato karkasai leido diferencijuoti MKL į chondrocitus (Awad et al. 2004). Chondrogeninio potencialo palaikymui buvo naudojami ir įvairūs natūralių medžiagų deriniai, tokie kaip alginato ir HA, HA ir chitosano, šilko fibroino ir chitozano, o taip pat ir sudėtinis želatinos, chitozano ir hialuronano karkasas su kovalentiškai sujungtu heparinu, leidžiančiu prisijungti bFGF (Tan et al. 2007). Tačiau šie sudėtiniai dariniai dažnai būna nepakankamai tvirti ir in vitro pagamintas tarpląselinis užpildas, įsodinus į sąnarį, greitai degraduoja, neatlaikęs spaudimo ir trinties.

Sintetinių biopolimerų karkasai

Sintetiniai karkasai gali būti skirstomi į kelias grupes: poli(hidroksi-rūgštys) yra dažniausiai naudojami biodegraduojantys polimerai, tokie kaip poli(glikolio rūgštis) (angliškai trumpinama PGA), poli(pieno rūgštis) (PLA) ir kt.; poli(ɛ-kaprolaktonai) (PCL); poli(uretanai) (PUR); poli(propileno fumaratai) (PPF); poli(etilen glikoliai) (PEG) ir kt. (Puppi 2010). Šios medžiagos palaiko chondrogeninę diferenciaciją, atlaiko spaudimą ir trintį sąnaryje, bet yra hidrofobiškos, neleidžia prisitvirtinti ląstelėms. Be to, jų degradacijos produktai yra rūgštiniai ar net toksiški ir gali sukelti itin stiprią uždegiminę reakciją, nors ir nesudaro sąlygų mikrobiniam užkratui bei nesukelia imuninio atmetimo.

Mišrūs karkasai

Pastaruoju metu kremzlės inžinerijai pradėti naudoti natūralių ir sintetinių biopolimerų deriniai, leidžiantys panaudoti skirtingų medžiagų privalumus, kadangi karkasų sudėtis, dydis, forma, akytumas ir mechaninės savybės stipriai įtakoja ląstelių chondrogeninę diferenciaciją, gyvybingumą, tarpląstelinio užpildo kokybę ir kitas svarbias atkuriamo audinio savybes. Daugeliu atvejų derinami tvirti karkasai su hidrogeliais, kad būtų gaunamas tiek geras ląstelių prikibimas, diferenciacija, tiek išlaikomos kremzlei tinkamiausios mechaninės savybės. Tokio sėkmingo derinio pavyzdžiu galėtų būti sintetinių karkasų derinimas su I tipo kolageno ar kitais hidrogeliais ir padaugintais chondrocitais arba MKL (Tanaka et al. 2010). Taip pat naudojami skirtingų sluoksnių karkasai, bandantys atkartoti natūralius kremzlės sluoksnius, šitaip sudarant sąlygas toms pačioms MKL ląstelėms diferencijuoti į skirtingų kremzlės zonų chondrocitus ir gaminti toms zonoms būdingą tarpląstelinį užpildą. Naujos kartos karkasai kuriami varijuojant sudedamąsias medžiagas, jų tankį, akytumą ir įvedant skirtingas bioaktyvias molekules, lemiančias kiekvienam sluoksniui būdingą ląstelių diferenciaciją. Karkasų savybės leido sukurti kremzlę, artimą hialininei, tačiau dažniausiai implanto sėkmingai integruoti į jį supantį audinį nepavyksta, nors implantas ir būna įklijuojamas fibrino klijais. Kita problema – sukurti dariniai vis dar neturi reikiamų fizinių-cheminių savybių lyginant su natyvine kremzle. Dažniausia priežastis ta, kad, kultivuojant ląsteles karkasuose, netaikomas mechaninis poveikis, būtinas teisingam hialininės kremzlės vystymuisi. Todėl pastaruoju metu kuriami bioreaktoriai, leidžiantys sukurti hidrostatinį slėgį ar mechaninį spaudimą, skysčio šlyties jėgą, tuo pačiu kontroliuojant pH, temperatūrą, deguonies koncentraciją, maisto medžiagų tiekimą ir metabolinių atliekų pašalinimą (Mabvuure et al. 2012).

Hipoksijos įtaka kremzlės inžinerijai

Nors chondrocitai nuolatos gyvena žemos deguonies koncentracijos sąlygomis, ilgą laiką kuriant kremzlę į hipoksinę aplinką nebuvo atsižvelgiama. Visuose organizmo audiniuose deguonies koncentracija niekada neviršija 10 % (ar 15 % tik plaučiuose). Kremzlė pasižymi žemiausia deguonies koncentracija visame kūne, nes ji neturi kraujotakos. Chondrocitams būdingas stebėtinas gebėjimas jausti deguonies kiekį ir tai sukelia žymias biologines pasekmes. Kremzlės vystymosi tyrimai parodė, kad net ir mezenchiminė blastema yra hipoksinė, o vienas svarbiausių ląstelės ir viso organizmo atsako į hipoksiją reguliatorių – transkripcijos faktorius HIF-1α, yra būtinas teisingam kremzlės vystymuisi nuo pat pirmųjų etapų iki galūnių ir sąnarių pilno susiformavimo, nes HIF-1α geno veikimo sustabdymas pelėse neleidžia susiformuoti normalioms galūnėms ir jų sąnariams (Provot et al. 2007). HIF-1α taip pat skatina II tipo kolageno ir agrekano raišką ir lemia teisingą kolageno brendimą – jo hidroksilinimą, būtiną kolageno molekulių tarpusavio jungčių formavimuisi besivystančioje individo augimo plokštelėje. Įdomu pažymėti, kad kito panašaus su hipoksija susijusio transkripcijos faktoriaus HIF-2α padidinta raiška lemia kremzlės degradaciją pelės osteoartrito modelyje, stimuliuodama hipertrofijos žymenų Col10a1, MMP13 ir VEGF, o taip pat ir agrekanazės ADAMTS4 raišką. Tačiau žmogaus chondrocitų atsakas į hipoksiją yra priešingas – jis skatina anabolinius procesus, nes didina II tipo kolageno ir agrekano raišką ir blokuoja kremzlės degradaciją, o HIF-2α, kaip ir HIF-1α, tiesiogiai dalyvauja Col2a1 stimuliuojant raišką (Lafont et al. 2007). Taip pat buvo parodyta, kad HIF-1α mažina Col1a1 raišką, susijusią su fibroblastiniu fenotipu, lemiančiu chondrocitų dediferenciaciją, kultivuojant juos monosluoksnyje. Hipoksija taip pat stabdė pelių riebalinio audinio MKL chondrogenezę, bet leido žmogaus kaulų čiulpų ir riebalinio audinio MKL diferencijuoti į chondrocitus (Markway et al. 2010; 299 Ronziere et al. 2010).

Visi šie duomenys rodo, kad žmogaus ir pelės chondrocitai skirtingai reaguoja į hipoksiją ir greičiausiai turi kitokių vystymosi skirtumų, todėl pelės modeliai negali pilnai paaiškinti procesų, vykstančių žmogaus kremzlėje.

Pagrindinė kliūtis, trukdanti naudoti MKL kremzlės inžinerijai, yra ta, kad šios ląstelės, diferencijuotos į chondrocitus, nesugeba išlikti šiame būvyje ir sparčiai hipertrofuoja, vėliau kalcifikuojasi ir kaulėja. Tyrimai rodo, kad šiame procese svarbų vaidmenį vaidina hipoksija, pavyzdžiui, riebalinio audinio MKL diferenciacija chondrogenine kryptimi hipoksijos sąlygomis išlaikė chondrogeninį fenotipą, o normoksijos sąlygomis perėjo į hipertrofinį fenotipą (Ronziere et al. 2010). Todėl manoma, kad hipoksija yra vienas iš parametrų, išlaikančių stabilią chondrogenezę ir stabdančių hipertrofiją. 

Mechaninė stimuliacija 

Sąnario kremzlės chondrocitai nuolatos patiria mechaninį spaudimą, todėl ir kremzlės inžinerijos darbuose palaipsniui imami taikyti bioreaktoriai, galintys naudoti auginamų chondrocitų ar MKL suspaudimą ar kitą mechaninę stimuliaciją – hidrostatinį slėgį, įvairaus stiprumo skysčio šlyties jėgą (Pav. 3). Tyrimai parodė, kad kai kurios iš šių jėgų gali padidinti II tipo kolageno ir GAG raišką kremzlėje arba in vitro auginamose ląstelėse, o taip pat apsaugoti kremzlę nuo suirimo (Tran et al. 2011).

3

Pav. 3. CartiGen C9-x bioreaktorius, leidžiantis vienu metu ciklišką suspaudimą ir trimatės ląstelių kultūros perfuziją. (Tran et al. 2011)

Klinikiniai ląstelių terapijos taikymo rezultatai 

ACI operacijų efektyvumas kelio kremzlės atkūrimui buvo tiriamas daugelyje klinikinių tyrimų ir išanalizuotas keliose apžvalginėse publikacijose (Peterson et al. 2010, Brittberg et al. 2010, Harris 2011). Pažymima, kad įvairiuose tyrimuose labai skyrėsi sąnario pažeidimo vertinimo balų sistemos, klinikinis vertinimas, apsunkinantys šių tyrimų palyginimą. Dėl to pabrėžiama būtinybė šias sistemas standartizuoti. Vis dėlto apžvalgos laiko ACI taikymą sėkminga klinikine praktika. 

Nuo pirmųjų ACI operacijų, atliktų Švedijoje Brittbergo ir Petersono, naudojant periosto lopinį, ir pademonstravusių gerus ir netgi puikius rezultatus 2 metų laikotarpiu, vėliau buvo apklausti keli šimtai ligonių, praėjus 10 ir netgi 20 metų po operacijos. 92 % ligonių įvertino operacijos rezultatus teigiamai ir pažymėjo, kad sutiktų ją vėl pakartoti (Peterson 2010). Kiti klinikiniai tyrimai, įvertinę ir antros bei trečios kartos ACI, taip pat pateikė bendras teigiamas išvadas (Vasiliadis et al. 2010, Vijayan et al. 2012). Apžvalgų autoriai pabrėžė sisteminio ir išsamaus duomenų įvertinimo būtinybę, o ypač ACI pasekmių histologinį vertinimą. 

Šiam tikslui ženkliai pasitarnautų ir ikiklinikiniai tyrimai su gyvūnais. Arklio sąnario tyrimai galėtų būti puikus OA patofiziologijos eksperimentinis modelis, kuris pasitarnautų tiek ligos biologinių žymenų paieškai, tiek gydymo strategijų kūrimui ir išbandymui. Visų pirma todėl, kad arkliams spontaniškai vystosi OA, tiek jauniems sportiniams žirgams, tiek jau pasenusiems arkliams, be to, eksperimentinis tokių pažeidimų modelis yra gerai ištirtas ir detaliai aprašytas (McIlwraith et al. 2012). Taip pat labai svarbu, kad arklio sąnario dydis ir kremzlės struktūra artima žmogaus, todėl tinka chirurginių procedūrų išbandymui. Be to, arkliai labai tinka pooperaciniam stebėjimui, skausmo lygio ir kitiems klinikiniams įvertinimams. Keletas ACI taikymo studijų arkliams jau yra atlikta eksperimentiškai sukeltiems kremzlės pažeidimams gydyti ir buvo gauti sėkmingi rezultatai (Barnewitz et al. 2006, Nixon et al. 2011).

Išvados

Kremzlės inžinerija pataruoju metu sparčiai vystosi ir jau yra pasiekusi svarbių sėkmingų rezultatų. Įvairūs karkasai leidžia nukreipti ląstelių vystymąsi norima linkme, kurti ir palaikyti kremzlei būdingą audinio struktūrą. Nors daugybė sukurtų ir jau išbandytų karkasų davė teigiamų rezultatų, jie vis dar turi nemažai trūkumų, kuriuos dar būtina pašalinti, kuriant idealią struktūrą bei parenkant tinkamas ląstelių kultivavimo fizikochemines sąlygas. Taip pat būtina išvystyti nebrangią bet saugią tokių konstruktų gamybą, taikant geros gamybos praktikos reikalavimus.

Šiuo etapu tinkamiausiu įsodinamų ląstelių šaltiniu vis dar laikomi autologiniai chondrocitai, tačiau kamieninių ląstelių, ir ypač kaulų čiulpų, MKL panaudojimas  taip pat atrodo perspektyvus, nes leidžia pateikti didelį ląstelių kiekį, kuris gali diferencijuoti į gyvybingus chondrocitus. Be to, MKL pasižymi imunosupresinėmis savybėmis ir tiekia aplinkai svarbius maitinamuosius faktorius, galinančius paskatinti audinio regeneraciją. Tačiau sėkmingam MKL taikymui dar reikalingi tolimesni tyrimai.

Specifinės kremzlės gyvavimo sąlygos reikalauja sukurti jas in vitro audinio inžinerijai atlikti. Tam tikslui reikalingi bioreaktoriai, galintys palaikyti hipoksiją, pritaikyti spaudimą ir kitas mechanines jėgas, tinkamai ir kontroliuojami tiekti chondrogenezę skatinančius ir palaikančius augimo faktorius bei kitas bioaktyvias molekules. 

Labai svarbi sėkmingos kremzlės inžinerijos dalis yra saugus ir teisingas jos įsodinimas ligoniui, standartizuotas ir patikimas tokių operacijų vertinimas klinikiniuose tyrimuose, ilgalaikis pooperacinis sekimas ir pastebėtų nepageidautinų pasekmių korekcija bei išvados tolimesniam procedūrų tobulinimui.

Literatūros sąrašas

[1] Awad, H. A.; Wickham, M.Q.; Leddy, H. A. et al. (2004) Biomaterials 25, 3211-3222.
[2] Barnewitz, D., Endres, M., Krüger, I. et al., (2006)  Biomaterials 27 2882–2889.
[3] Bhosale, A. M., Richardson, J. B. (2008) British medical bulletin 87: 77–95.
[4] Brittberg, M., Lindahl, A., Nilsson , A., et al. (1994) N Engl J Med 331(14):889-95.
[5] Brittberg, M. (2010) Am J Sports Med 38(6):1259-71.
[6] Cheng, C., Conte, E., Chamacho, M. P., et al. (2007) Matrix biol 26(7): 541–553.
[7] Chiang, H., Jiang, C. C. J. (2009) Formos Med Assoc 108(2):87–101.
[8] Dickhut, A., Pelttari, K., Janicki, P., et al. (2009) J. Cell. Physiol 219(1):219-26.
[9] Diaz-Romero, J., Gaillard, J. P., Grogan, S. P., et al. (2005) J. Cell. Physiol 202: 731–742.
[10] Diaz-Romero, J., Nesic, D., Grogan, S. P. (2008). J. Cell. Physiol. 214, 75–83.
[11] Demoor, M., Maneix. L, Ollitrault, D. (2012) Pathologie Biologie 60:199–207
[12] Domm, C., Schünke, M., Christesen, K. et al. (2002) Osteoarthritis and Cartilage 10: 13-22.
[13] Dowthwaite, G. P., Bishop, J. C, Redman, S. N. et al. (2004) Journal of Cell Science 117: 889-897.
[14] Finkel, T., Holbrook, N. (2000) Nature 408: 239-247.
[15] Freyria, A. M., Ronzière, M.C., Cortial, D. et al. (2009) Tissue Engineering Part A. 15: 1233-1245 
[16] Gan, L., Kandel, R. A. (2007) Tissue Eng 13:831–842.
[17] Gavénis, K., Schmidt-Rohlfing, B. et al. (2006) In Vitro Cell Dev Biol Anim 42(5-6):159-67.
[18] Giovannini, S., Diaz-Romero, J., Aigner, T. et al. (2010) J Cell Physiol 222:411-20.
[19] Goessler, U.R., Bieback, K., Bugert, P., et al. (2006) Int J Mol Med 17(2):301-7.
[20] Goldring, M. B., Goldring, S. R. (2007) Osteoarthritis. J. Cell. Physiol  213: 626–634.
[21] Goldring, M. B., Marcu, B. (2009) Arthritis Res. Ther 11:224-240.
[22] Grogan, S. P., Rieser, F., Winkelmann, V. et al. (2003) Osteoarthritis Cartilage 11(6):403-11.
[23] Grogan, S. P, Barbero, A., Diaz-Romero, J. et al. (2007) Arthritis and rheum 56(2): 586–595.
[24] Grogan, S. P., Miyaki, S., Asahara, H., D‘Lima, D. D., Lotz., M. (2009) Arthritis Res Ther 11(3):R85.
[25] Hardingham, T. E., Oldershaw, R. A., Tew, S. R. (2006) Cartilage, SOX9 and Notch signals in chondrogenesis. J Anat 209(4):469-80.
[26] Harris, J. D., Siston, R. A., Brophy, R. H. et al. (2009) Osteoarthritis Cartilage. 2011;19: 779-791.
[27] Kumar, D., Lassar,  A. B. (2009) Mol Cell Biol 29:4262-73. 
[28] Lafont, J. E., Talma, S. and Murphy, C. L. (2007) Arthritis & Rheumatism 56: 3297–3306, 
[29] Lee, Y. A., Kang, S. S., Baek, S. H. et al. (2007) Molec. and Cells 24:9-15.
[30] Li, W. J., Chiang, H., Kuo, T. F. et al. (2009) J Tissue Eng Regen Med 3: 1–10.
[31] Mabvuure, N., Hindocha, S., Khan, W.S. (2012) The role of bioreactors in cartilage tissue engineering. Curr Stem Cell Res Ther 7(4):287 – 292
[32] Markway, B. D., Tan, G. K., Brooke, G. et al. (2010) Cell Transpl 19: 29-42.
[33] McIlwraith, C. W., Frisbie, D. D., Kawcak, C. E. (2012) Bone Joint Res 1:297–309.
[34] Murphy, C. L., Thoms, B. L., Vaghjiani, R. J. et al. (2009) Arthritis Res. Ther 11:213.
[35] Mutabaruka, M. S., Aissa, M. A., Delalandre, A. et al. (2010) Arthritis Res Ther 12(1):R20.
[36] Nixon, A. J., Begum, L., Mohammed, H. O. et al. (2011) J. Orthop. Res 29:1121–1130.
[37] Peterson, L., Vasiliadis, H. S., Brittberg, M. et al. (2010) The American Journal of Sports Medicine 38:1117-1124
[38] Provot, S, Zinyk, D., Gunes, Y. et al. (2007) JCB 177:451-464.
[39] Punzi, L., Oliviero, F., Ramonda, R. (2010) EJMS.
[40] Puppi, D., Chiellini, F., Piras, A. M. et al. (2010) Progr. Polymer Sci 35:403–440.
[41] Rahfoth, B., Weisser, J., Sternkopf, F. et al. (1998) Osteoarthritis and Cartilage 6:50-65.
[42] Ronziere, M. C., Perrier, E., Mallein-Gerin, F. et al. (2010) Bio-medical Mat. Engin 20 :145-158.
[43] Schulze-Tanzil, G. (2009) Activation and dedifferentiation of chondrocytes: implications in cartilage injury and repair. Ann Anat 191(4):325-338 
[44] Tan, H., Gong, Y., Lao, L. et al. (2007) J Mater Sci: Mater Med 18:1961–1968.
[45] Tan, A. R., Dong, E. Y., Andry, J. P. et al. (2011) Clin. Orthop. Relat. Res 469:2735–2743.
[46] Tanaka, Y., Yamaoka, H., Nishizawa, S. et al. (2010) Biomaterials 31:4506-4516.
[47] Tew, S. R., Murdoch, A. D., Rauchenberg, R. P. et al. (2008) Methods 45(1):2-9.
[48] Tran, S. C., Cooley, A. J. and Elder, S. H. (2011) Biotechnology and Bioengineering 108:1421–1429.
[49] Tsuchiya, K., Chen, G., Ushida, T. (2004) Mater. Sci. Eng. C 24:391–396.
[50] Yang, L., Carlson, S. G., McBurney, D. et al. (2005) JBC 280: 31156–31165.
[51] Yunta, M., Lazo, P. A. (2003) Cell Signal 15:559-564.
[52] Vasiliadis, H. S., Wasiak, J., Salanti, G. (2010) Knee Surg. Sports Traumatol. Arthrosc 18:1645–1655.
[53] Vijayan, S., Bartlett, W., Bentley, G. et al. (2012) J. Bone Joint Surg. (Br.) 94:488–492.
[54] Wei, Y., Zeng, W., Wan, R. et al. (2012) Eur. Cell Mater 23:1–12.
[55] Wonga, M., Carter, D. R. (2003) Articular cartilage functional histomorphology and mechanobiology: A Research Perspective, Bone 33:1–13.
[56] Wu, L., Prins, H.-J., Helder, M. N. et al. (2012)Tissue Eng. A 18:1542–1551.

Lecturer